Summary
植物角质层蜡质植物的外壳，在节约用水的主要作用，但也是对病原微生物的入境重要屏障。在这段视频中，我们展示了正向和反向遗传学方法所确定的植物角质层突变体的分析。
Abstract
植物角质层蜡质覆盖在植物上，有一个节约用水的主要作用外，也是对病原微生物的入境重要屏障。角质层是由所谓的“角质”一个艰难的交联聚合物和保护蜡层密封植物表面。许多植物的角质层的蜡质层明显，出现的常春藤叶上的一个闪亮的电影或作为一个尘土飞扬的的葡萄或白菜叶感谢蜡光散射晶体表面上的外壳。由于角质层是植物必需适应地面环境，了解植物角质层的形成有关的基因已应用在农业和林业。今天，我们将展示植物角质层的正向和反向遗传学方法确定突变体的分析。
Protocol
一，视觉画面和反向遗传方法来确定角质层的突变体。
角质层在模式植物拟南芥突变体被称为“eceriferum”的突变体，这意味着“不轴承蜡”。他们可以在视觉屏幕，也就是说，只是在寻找突变，你可以看到，野生型植株的花序干发白，而突变体深绿色有光泽的茎。是在这种类型的视觉画面隔离的突变体之一，这是一个叫做eceriferum4或cer4。
发现有趣的角质层突变体的另一种方法是用反向遗传学方法：利益选择的候选基因，然后该基因研究植物线路中断。这些突变TDNA扰乱感兴趣的基因，在这种情况下，细胞色素P450，我们现在所说的MAH1。
PCR检测结果（如在视频中显示的）可以确认，TDNA插入感兴趣的基因。当两个基因特异引物用于扩增野生型DNA，我们看到一个产品，但如果TDNA中断，在这种突变，有没有产品。相反，使用具体TDNA和基因的引物，只看到一个产品是在突变。我们期待为纯合子突变线，双方的母亲和父亲的基因副本都被打乱。如果一个基因副本是扰乱TDNA和其他副本仍然是野生型的PCR结果好坏参半。
二。使用气相色谱法确定Cutlicle蜡的化学成分。
我们分析使用气相色谱蜡的化学成分。首先，可溶性蜡化合物是从植物表面，在氯仿中浸泡。
然后，样品注入气相色谱列，他们将在那里被加热，并通过气体流发送。坚持或多或少不同的化合物之列的墙壁，分离的化合物，和他们出来后，在色谱柱的另一端，其他之一。那么，作为化合物的火焰离子化检测通过，我们看到的高峰。中的各峰的保留时间的特点是不同的化合物，质谱，我们已经确定拟南芥蜡的组成部分。目前的主要山峰C29正构烷烃，C29酮和C29仲醇。小峰的二级醇，脂肪酸，醛类和酯类。根据峰面积，相对标准，告诉我们多少每种化合物存在。
在从这些角质层突变体的气体色谱时，人们可以看到如何cer4缺乏主要的醇类和酯类，而mah1缺乏二级醇酮。这些表型可以告诉我们很多有关的功能基因在植物的兴趣。例如，我们才知道在cer4一线的基因突变，表型告诉我们，在伯醇的生物合成途径分支问题。后在孔斯特实验室研究该基因的分子身份，它被发现，它的脂肪酰基还原酶的基因家族，这正好与此化学表型的一部分。
三。使用的Cryo - SEM确定角质层的晶体结构
当我们研究的拟南芥角质层突变体，我们可以看到，如果他们有深绿色，有光泽的表型或野生型干发白外观。我们用扫描电子显微镜看在植物表面的角质层和识别的视觉表型的基础上。我们利用低温扫描电镜，冻结的植物和观看他们在液氮温度下，为了保持角质层的完整，因为SEM需要真空操作，并没有使他们冻结，样品将干出和折叠。
这里cer4和mah1样品，与野生型控制，是解剖和冷冻的扫描电镜存根上。当样品被转移到显微镜的冷阶段，你可以看到，野生型拟南芥茎角质层的表面晶体覆盖。这是光散射这些晶体，使干发白外观。这里是cer4干;记得它看起来有光泽？它没有表面上的晶体。
人们曾做过实验，他们隔离纯蜡化合物从一种植物的角质层，当他们在实验室中重结晶，晶体形成的植物上发现相同的形状。在拟南芥中，我们相信晶体化合物的混合物，情况比较复杂。例如，化学分析显示，在cer4，只有轻微的伯醇及其衍生酯组成部分丢失，但对行政长官的晶体R4干都没有了。 mah1情况下，细胞色素P450酶基因突变的影响，突变株缺乏蜡，二级醇类及酮类的两个主要组成部分，但对mah1植物的晶体形式通常。
要了解更多有关拟南芥角质层突变体， 请去植物生物学的年度审查。
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