Summary
식물 표피 물 절약의 기본 역할을뿐만 아니라, 병원성 미생물의 항목에 대한 중요한 장애가 식물에 밀랍 외부 덮개입니다. 이 비디오에서는, 우리는 순방향 및 역방향 유전학 방법으로 식별 식물 표피의 돌연변이의 분석을 보여줍니다.
Abstract
식물 표피 물 절약의 기본 역할을 식물에 밀랍 외부 실정입니다뿐만 아니라, 병원성 미생물의 항목에 대한 중요한 장벽입니다. 표피는 "cutin"라는 힘든 가교 폴리머 및 보호 왁스 층 바다표범 식물 표면 구성되어 있습니다. 표피의 밀랍 층 아이비 잎에 빛나는 영화 또는 포도 또는 왁스에있는 산란 결정을 밝힐 수 양배추 리프 감사의 표면에 먼지가 외부 덮개으로 나타나는 많은 식물에 분명합니다. 표피가 이해, 지상파 환경에 식물의 필수 적응하기 때문에 식물 표피 형성에 관련된 유전자는 농업과 임업 모두에서 응용 프로그램을하고 있습니다. 오늘, 우리는 순방향 및 역방향 유전학 방법으로 식별 식물 표피의 돌연변이의 분석을 보여 드리죠.
Protocol
I. 비주얼 화면 및 역방향 유전자 접근 표피 돌연변이를 확인합니다.
모델 식물 Arabidopsis thaliana의에서 표피의 돌연변이가 "베어링하지 왁스"를 의미하는 "eceriferum"돌연변이,라고합니다. 그들은 영상 화면에서 수, 즉, 그냥 돌연변이보고에 의해, 당신은 돌연변이가 녹색으로 어두운 반짝 스템을하면서 야생 타입 식물의 꽃이 핌 줄기가 약간 흰 것을 볼 수 있습니다. 영상 화면이 유형의 격리되었다 돌연변이 중 하나는이, eceriferum4 또는 cer4이라고합니다.
재미있는 표피의 돌연변이를 발견의 또 다른 방법은 역방향 유전학 접근이다 : 관심의 선택 후보 유전자 그리고 그 유전자를 공부하고 공장 라인 중단. 이러한 돌연변이 TDNA 우리가 지금 MAH1 전화 것이,이 경우, 시토크롬 P450 관심의 유전자를 방해했습니다.
PCR 결과 (동영상에 표시된 것과 같은) TDNA 삽입 관심의 유전자에있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 유전자 특정 primers는 야생 형 유전자를 증폭하기 위해 사용하는 경우, 우리는 제품을 볼 수 있지만, TDNA가 인터럽트를하는 경우,이 돌연변이에서와 같이, 거기에는 제품이 없습니다. 반대로, TDNA 및 유전자 특정 primers를 사용하여 제품은 돌연변이에서 볼 수 있습니다. 우리는 유전자의 모자 아버지 사본을 모두 방해 아르 homozygous 돌연변이 라인을 찾습니다. 유전자의 한 복사본은 TDNA에 의해 방해와 다른 사본이 아직 와일드 타입이다면, PCR 결과는 혼합 수 있습니다.
II. Cutlicle 왁스의 화학 성분을 확인하는 가스 크로마 토그래피를 사용하여.
우리는 가스 크로마 토그래피를 사용하여 왁스의 화학 성분을 분석. 첫째, 수용성 왁스 화합물은 클로로포름에 디핑하여 식물 표면에서 제거됩니다.
그들이 가열 가스의 흐름을 통해 발송됩니다 어디 그런 다음 샘플은 가스 크로마 토그래피 칼럼에 주입하고 있습니다. 다른 화합물은 화합물을 분리, 컬럼의 벽에 더 많은 이하 스틱, 그리고 그들이 칼럼의 다른 끝에있는 다른 후 하나를 나와. 화합물은 불꽃 이온화 검출기를 통해 통과로 그 다음, 우리는 봉우리를 참조하십시오. 각 피크의 유지 시간이 서로 다른 화합물에 대한 특성이며, 질량 분광법에서, 우리는 Arabidopsis 왁스의 각각의 구성 요소를 확인합니다. 주요 봉우리 현재 C29 alkane, C29 케톤과 C29 차 알코올의 수 있습니다. 작은 봉우리는 이차 알콜, 지방산, aldehydes 및 에스테르입니다. 표준에 상대적인 봉우리 아래에있는 지역은, 얼마나 많은 화합물이 존재하는 우리에게 알려줍니다.
이러한 표피의 돌연변이에서 가스 chromatograms에서 볼 때, 하나는 mah1 보조 알콜과 ketones이 부족하면서 cer4은 기본 알콜과 에스테르를 결여하는 방법 통보하실 수 있습니다. 이러한 phenotypes 우리 공장에 대한 관심의 유전자의 기능에 대해 많은 걸 알 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 cer4 라인 변이되었던 유전자 알고 전에 표현형은 biosynthetic 경로의 기본 알코올 지점에서 문제가 중이랍니다. 그 유전자의 분자 ID가 Kunst 연구실에서 공부 후, 그것은 그것이 화학 표현형 잘 맞는 지방산 아실 reductases의 유전자 가족의 일부임을 발견했다.
III. 표피 결정의 구조를 확인하는 Cryo - SEM을 사용하여
그들은 어두운 녹색, 광택 표현형 또는 줄기에있는 야생 - 타입 약간 흰 모양이있다면 우리가 Arabidopsis 표피의 돌연변이를 연구하면, 우리는 볼 수 있습니다. 우리는 식물의 표면에 표피보고 시각 표현형의 근거를 확인하기 위해 스캔 전자 현미경을 사용합니다. 우리는 SEM이 작동 진공을 필요로하고 그들을 냉동 보관하지 않고, 샘플가 건조하고 붕괴 것이 때문에 표피가 그대로 유지하기 위해 식물을 냉동 및 액체 질소 온도에서 그들을보고, cryo - SEM을 사용합니다.
여기 cer4 및 mah1 샘플은 야생 형 컨트롤과 함께 해부하고 SEM의 스텁에 냉동. 샘플은 현미경의 추위 단계로 전학하는 경우, 당신은 야생 형 Arabidopsis의 줄기 표피의 표면이 결정으로 덮여있다는 것을 알 수 있습니다. 그것은 줄기에게 그 약간 흰 모양을 제공합니다 그 결정을 분산하는 빛이다. 여기 cer4 줄기는, 그것이 광택 보였 기억나요? 그것은 표면에 크리스탈이 부족.
그들은 식물의 표피에서 순수한 왁스 화합물을 분리하고 그들은 실험실에서 recrystallize 때 수정이 식물에서 찾은 것과 같은 모양을 형성 어디에 사람들이 실험을 완료했습니다. Arabidopsis에서, 우리는 결정이 화합물의 혼합물로 구성되어 있으며 상황이 더 복잡합니다 있다고 믿습니다. 예를 들어, 화학 분석 cer4에 기본 알콜 및 파생 에스테르만을 작은 구성 요소가 누락되는 우리를 보여주는 아직 CE에서 결정R4 줄기 가고 있습니다. mah1의 경우에는, 그 시토크롬 P450 효소에 돌연변이의 효과는 돌연변이 식물 왁스, 보조 알콜 및 ketones의 두 가지 주요 구성 요소를 부족, 아직 mah1 식물에있는 크리스탈가 정상적으로 형성한다는 것입니다.
Arabidopsis 표피의 돌연변이에 대한 자세한 내용하려면로 이동하십시오 식물 생물학의 연례 검토 .
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