Summary
La cuticule des plantes est un revêtement cireuse externe sur les plantes qui ont un rôle primordial dans la conservation de l'eau, mais est également une barrière importante contre l'entrée de microorganismes pathogènes. Dans cette vidéo, nous démontrons l'analyse de mutants végétaux cuticules identifiés par des approches de génétique directe et inverse.
Abstract
La cuticule des plantes est un revêtement cireuse externe sur les plantes qui ont un rôle primordial dans la conservation de l'eau, mais est également une barrière importante contre l'entrée de microorganismes pathogènes. La cuticule est constituée d'un polymère réticulé difficiles appelé "cutine" et une couche de cire protectrice qui scelle la surface de la plante. La couche cireuse de la cuticule est évident sur de nombreuses plantes, apparaissant comme un film brillant sur la feuille de lierre ou une couverture poussiéreuse extérieur sur la surface d'un cépage ou une feuille de chou grâce à la lumière des cristaux de diffusion présents dans la cire. Parce que la cuticule est une adaptation essentielle des plantes à un environnement terrestre, la compréhension des gènes impliqués dans la formation cuticule des plantes a des applications tant dans l'agriculture et la foresterie. Aujourd'hui, nous allons montrer l'analyse de mutants végétaux cuticules identifiés par des approches de génétique directe et inverse.
Protocol
I. écrans visuels et Reverse approches génétiques pour identifier les mutants cuticules.
Mutants cuticules dans la plante modèle Arabidopsis thaliana sont appelés «eceriferum« mutants, qui signifie «ne portant pas de cire". Ils peuvent être des écrans visuels, qui est, juste en regardant le mutant, vous pouvez voir que la tige inflorescence de plantes de type sauvage est blanchâtre tandis que les mutants ont des tiges vert foncé brillant. L'un des mutants qui a été isolé dans ce type d'écran visuel est celui-ci, appelé eceriferum4 ou cer4.
Une autre façon de découvrir les mutants cuticule est intéressant avec une approche de génétique inverse: le choix des gènes candidats de l'intérêt et ensuite lignées de plantes à étudier avec ce gène perturbé. Ces mutants ont TDNA perturber le gène d'intérêt, dans ce cas, un cytochrome P450 que nous appelons maintenant MAH1.
Résultats de la PCR (comme celle montrée dans la vidéo) peut confirmer que l'insertion TDNA est dans le gène d'intérêt. Lorsque deux gènes amorces spécifiques sont utilisées pour amplifier l'ADN de type sauvage, nous voyons un produit, mais si le TDNA elle interrompt, comme dans ce mutant, il n'existe aucun produit là-bas. A l'inverse, en utilisant des amorces spécifiques pour la TDNA et de gènes, un produit ne se voit que chez le mutant. Nous recherchons des lignées mutantes homozygotes, où les deux copies maternelle et paternelle du gène sont perturbés. Si une seule copie du gène est perturbée par TDNA et l'autre copie est toujours de type sauvage, les résultats de la PCR sont mélangés.
II. Chromatographie en phase gazeuse pour déterminer la composition chimique de la cire Cutlicle.
Nous analysons la composition chimique de la cire en utilisant la chromatographie gazeuse. Premièrement, les composés solubles de cire sont retirés de la surface de la plante en la trempant dans du chloroforme.
Ensuite, des échantillons sont injectés dans la colonne de chromatographie en phase gazeuse, où ils seront chauffés et envoyés par le biais d'un flux de gaz. Différents composés coller plus ou moins sur les murs de la colonne, la séparation des composés, et ils sortent l'un après l'autre à l'autre bout de la colonne. Puis, comme les composés passent par le détecteur à ionisation de flamme, nous voyons les sommets. Le temps de rétention de chaque pic est caractéristique pour différents composés et, à partir de la spectrométrie de masse, nous avons identifié chacun des éléments de la cire d'Arabidopsis. Les pics majeurs sont actuellement celle de l'alcane C29, C29 la cétone et l'alcool C29 secondaire. Les pics mineurs sont les alcools secondaires, acides gras, aldéhydes et des esters. L'aire sous les pics, par rapport à la norme, nous dit quelle quantité de chaque composé est présent.
Lorsque l'on regarde chromatogrammes en phase gazeuse à partir de ces mutants cuticule, on peut remarquer combien cer4 manque des alcools primaires et les esters, tandis mah1 manque alcools secondaires et les cétones. Ces phénotypes peuvent nous en dire beaucoup sur la fonction du gène d'intérêt dans l'usine. Par exemple, avant nous savions ce qui gène a été muté dans la ligne cer4, le phénotype nous a dit qu'il y avait un problème dans la branche alcool primaire de la voie de biosynthèse. Après l'identité moléculaire de ce gène a été étudiée dans le laboratoire Kunst, on a découvert qu'il fait partie d'une famille de gènes des réductases acyle gras, ce qui correspond bien à ce phénotype chimique.
III. Par cryo-SEM pour déterminer la structure des cristaux cuticules
Quand nous étudions les mutants d'Arabidopsis cuticules, nous pouvons voir si elles ont la couleur vert foncé, brillantes phénotype ou l'apparition de type sauvage blanchâtre sur la tige. Nous utilisons le microscope électronique à balayage à regarder la cuticule à la surface de la plante et d'identifier la base du phénotype visuel. Nous utilisons des cryo-MEB, le gel des plantes et les visionner à la température d'azote liquide pour conserver la cuticule intacte parce que le MEB nécessite un vide à fonctionner sans les garder congelés, les échantillons ne se dessèchent et l'effondrement.
Voici cer4 et mah1 échantillons, ainsi que les contrôles de type sauvage, sont disséqués et congelés sur le MEB. Lorsque les échantillons sont transférés dans le froid au stade du microscope, on peut voir que la surface de la cuticule de type sauvage Arabidopsis tige est recouvert de cristaux. Il est la lumière qui est la diffusion à partir de ces cristaux qui donne la tige de son aspect blanchâtre. Voici la tige cer4, souvenez-vous il semblait glacé? Il manque les cristaux sur la surface.
Les gens ont fait des expériences où ils isoler un composé de cire pure de la cuticule de la plante et quand ils le recristalliser dans le laboratoire, les cristaux se forment les mêmes formes que celles trouvées sur les plantes. Chez Arabidopsis, nous croyons que les cristaux sont constitués d'un mélange de composés, et la situation est plus compliquée. Par exemple, l'analyse chimique nous montre que dans cer4, seule la composante mineure d'alcools primaires et leurs esters dérivés sont manquants, mais les cristaux sur la CEr4 souches sont allés. Dans le cas de mah1, l'effet de la mutation de cette enzyme cytochrome P450 est que les plantes mutantes manque deux éléments majeurs de la cire, les alcools secondaires et les cétones, mais les cristaux sur la mah1 plantes forment normalement.
Pour en savoir plus sur les mutants d'Arabidopsis cuticules s'il vous plaît aller à Annual Review of Plant Biology .
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