Summary
A cutícula é uma planta que cobre waxy exterior sobre as plantas que tem um papel fundamental na conservação da água, mas também é uma importante barreira contra a entrada de microorganismos patogênicos. Neste vídeo, demonstramos a análise de mutantes de plantas cutícula identificados por abordagens frente e verso genética.
Abstract
A cutícula é uma planta que cobre waxy exterior sobre as plantas que tem um papel fundamental na conservação da água, mas também é uma importante barreira contra a entrada de microorganismos patogênicos. A cutícula é composta de um polímero reticulado resistente chamado "cutina" e uma camada de cera protetora que sela a superfície da planta. A camada cerosa da cutícula é óbvio em muitas plantas, aparecendo como um filme brilhante sobre a folha de hera ou como uma cobertura externa empoeirado na superfície de uma uva ou uma folha de couve, graças à luz cristais dispersão presente na cera. Porque a cutícula é uma adaptação de plantas essenciais para um ambiente terrestre, o entendimento dos genes envolvidos na formação da cutícula planta tem aplicações tanto na agricultura e silvicultura. Hoje, vamos mostrar a análise de mutantes de plantas cutícula identificados por abordagens frente e verso genética.
Protocol
Screens I. Visual e Reverse abordagens genéticas para identificar mutantes cutícula.
Mutantes cutícula na planta modelo Arabidopsis thaliana são chamados de "eceriferum" mutantes, que significa "cera não tendo". Elas podem ser em telas de visual, ou seja, só de olhar para o mutante, você pode ver que a haste da inflorescência do tipo selvagem plantas é esbranquiçada, enquanto os mutantes têm hastes verde-escuro brilhante. Um dos mutantes que foi isolado neste tipo de tela de visual é um presente, chamado ou eceriferum4 cer4.
Outra forma de descobrir mutantes cutícula interessante é com uma abordagem genética reversa: genes candidatos a escolha de interesse e linhas de plantas estudando com esse gene interrompido. Estes mutantes têm DNAt interrompendo o gene de interesse, neste caso, um citocromo P450, que hoje chamamos MAH1.
Resultados da PCR (como a mostrada no vídeo) pode confirmar que a inserção DNAt está no gene de interesse. Quando dois genes específicos são usados primers para amplificar DNA do tipo selvagem, vemos um produto, mas se o DNAt interrompe-lo, como neste mutante, não há nenhum produto lá. Por outro lado, usando primers específicos para o gene DNAt e, um produto só é visto no mutante. Procuramos homozigotos linhagens mutantes, onde ambas as cópias materna e paterna do gene são interrompidos. Se uma cópia do gene é interrompido por DNAt ea outra cópia é ainda de tipo selvagem, os resultados da PCR são misturados.
II. Usando Cromatografia Gasosa para determinar a composição química da cera Cutlicle.
Analisamos a composição química da cera utilizando cromatografia gasosa. Primeiro, os compostos de cera solúvel são removidos da superfície da planta por meio de imersão em clorofórmio.
Então, as amostras são injetadas na coluna de cromatografia gasosa, onde serão aquecidas e enviado através de um fluxo de gás. Diferentes compostos vara mais ou menos às paredes da coluna, separando os compostos, e eles saem um depois do outro na outra extremidade da coluna. Então, como os compostos de passar o detector de ionização de chama, vemos os picos. O tempo de retenção de cada pico é característico de compostos diferentes e, a partir de espectrometria de massa, nós identificamos cada um dos componentes da cera Arabidopsis. Os picos principais presentes são o do alcano C29, C29 a cetona e do álcool C29 secundário. Os picos menores são os álcoois secundários, ácidos graxos, aldeídos e ésteres. A área sob os picos, em relação ao padrão, nos diz o quanto de cada composto está presente.
Ao olhar para cromatogramas do gás destes mutantes cutícula, pode-se notar como cer4 carece de álcoois primários e ésteres, enquanto mah1 carece de álcoois secundários e as cetonas. Estes fenótipos podem nos dizer muito sobre a função do gene de interesse na planta. Por exemplo, antes de sabermos qual o gene sofre mutação na linha cer4, o fenótipo nos disse que havia um problema no ramo de álcool primário da via biossintética. Após a identidade molecular desse gene foi estudado no laboratório Kunst, descobriu-se que é parte de uma família de genes de reductases acila graxos, que se encaixa bem com esse fenótipo química.
III. Usando Cryo-SEM para determinar a estrutura dos cristais cutícula
Quando estudamos os mutantes cutícula Arabidopsis, podemos ver se eles têm o fenótipo escuro, verde brilhante ou a aparência do tipo selvagem esbranquiçada na haste. Nós usamos o microscópio eletrônico de varredura de olhar para a cutícula na superfície da planta e identificar a base do fenótipo visual. Usamos crio-SEM, congelamento das plantas e vê-las à temperatura de nitrogênio líquido, a fim de manter a cutícula intacta porque o SEM exige um vácuo para operar e sem mantê-los congelados, amostras secaria e colapso.
Aqui cer4 e mah1 amostras, juntamente com os controles do tipo selvagem, são dissecados e congelados no topo SEM. Quando as amostras são transferidas para o frio estágio do microscópio, você pode ver que a superfície da cutícula-tronco do tipo selvagem Arabidopsis é coberto com cristais. É a luz que está espalhando fora aqueles cristais que dá a haste sua aparência esbranquiçada. Aqui é o tronco cer4, lembre-se que parecia brilhante? Ela não tem os cristais na superfície.
As pessoas têm feito experimentos onde isolar um composto de cera pura da cutícula de uma planta e quando eles recrystallize-lo no laboratório, os cristais formam as mesmas formas como os encontrados nas plantas. Em Arabidopsis, acreditamos que os cristais são constituídos por uma mistura de compostos ea situação é mais complicada. Por exemplo, a análise química nos mostra que em cer4, apenas o componente menor de álcoois primários e seus derivados ésteres estão faltando, no entanto, os cristais sobre o cer4-tronco já se foram. No caso de mah1, o efeito da mutação em que a enzima citocromo P450 é que as plantas mutantes falta dois principais componentes da cera, álcoois secundários e as cetonas, mas os cristais na mah1 plantas formam normalmente.
Para saber mais sobre os mutantes cutícula Arabidopsis acesse Revisão Anual de Biologia Vegetal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
