Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.
Oppervlakte-eiwitten staan centraal in het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en de interactie met naburige cellen. Ze staan bekend als inductoren van bijna alle intracellulaire signalering. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in het milieu aanpassing en behandeling met geneesmiddelen, en zijn vaak betrokken zijn bij de ziekte pathogenese en pathologie (1). Eiwit-eiwit interacties zijn intrinsiek aan signaalwegen, en om meer inzicht te krijgen in deze complexe biologische processen, zijn gevoelige en betrouwbare methoden nodig voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten. Twee-dimensionale (2-D) electroforese wordt op grote schaal gebruikt voor de detectie van biomarkers en andere doelen in complexe eiwit monsters differentiële veranderingen te bestuderen. Cel oppervlakte-eiwitten, mede door hun lage abundantie (1 2% van cellulaire eiwitten), zijn moeilijk te detecteren in een 2-D gel zonder fractionering of een andere vorm van verrijking. Ze zijn ook vaak slecht vertegenwoordigd in 2-D gels vanwege hun hydrofobe karakter en een hoog moleculair gewicht (2). In deze studie presenteren we een nieuw protocol voor het intacte cellen met behulp van CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen voor specifieke etikettering en de opsporing van deze belangrijke groep van eiwitten. De resultaten toonden aan specifieke etikettering van een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten met een minimale etikettering van intracellulaire eiwitten. Dit protocol is een snelle, eenvoudig te gebruiken, en alle drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen (Cy 2, 3 en Cy Cy 5) kan worden gebruikt om cel-oppervlakte-eiwitten label. Deze functies zorgen voor multiplexing het gebruik van de 2-D fluorescentie Verschil gelelektroforese (2-D DIGE) met Ettan DIGE techniek en de analyse van eiwit-expressie veranderingen met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Het niveau van de cel-oppervlakte-eiwitten werd gevolgd tijdens het serum uithongering van de CHO-cellen voor verschillende lengtes van de tijd (zie tabel 1). Kleine veranderingen in overvloed werden gedetecteerd met hoge nauwkeurigheid, en de resultaten worden ondersteund door omschreven statistische methoden.
Eiwitconcentratie
Een overzicht van de twee etikettering workflows is weergegeven in figuur 1. Omdat de cellen zijn nog steeds intact wanneer geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol, worden alleen de cel oppervlakte-eiwitten worden blootgesteld aan de kleurstof. In de standaard Ettan DIGE protocol, worden de cellen gelyseerd voor de etikettering en de eiwitten zowel binnen als buiten de cel zijn gelabeld (Fig 1). De relatieve hoeveelheid kleurstof aan eiwit in de cel-…
Wij danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer en Sigurd Krieger aan het Instituut voor Klinische Pathologie van de Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor hun samenwerking.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |