En enkel och specifik metod visades för lysrör märkning och förbättrad detektering av proteiner cellens yta utan en fraktionering steg. Differential överflöd i proteiner på cellens yta analyserades med hjälp av tvådimensionella (2-D) elektrofores och Ettan ™ Dige teknik.
Ytproteiner är centrala för cellens förmåga att reagera på sin omgivning och att samverka med angränsande celler. De är kända för att vara inducerare av nästan alla intracellulär signalering. Dessutom spelar de en viktig roll i miljöanpassning och missbruksbehandling, och deltar ofta i sjukdomens patogenes och patologi (1). Protein-protein interaktioner är inneboende signalvägar, och för att få mer insikt i dessa komplexa biologiska processer, är känsliga och tillförlitliga metoder som behövs för att studera proteiner på cellens yta. Tvådimensionella (2-D) elektrofores används i stor utsträckning för detektion av biomarkörer och andra mål i komplexa protein prover för att studera differentiella förändringar. Cellytan proteiner, delvis på grund av deras låga förekomst (1 2% av cellulära proteiner), är svåra att upptäcka i en 2-D gel utan fraktionering eller någon annan typ av berikning. De är också ofta dåligt representerade i 2-D-geler på grund av sin hydrofoba natur och höga molekylvikten (2). I denna studie presenterar vi ett nytt protokoll för intakta celler med CyDye Dige Fluor minimal färgämnen för särskild märkning och upptäckt av denna viktiga grupp av proteiner. Resultaten visade särskild märkning av ett stort antal proteiner på cellens yta med minimal märkning av intracellulära proteiner. Detta protokoll är snabb, enkel att använda, och alla tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen (Cy 2, Cy 3 och Cy 5) kan användas för att märka proteiner på cellernas ytor. Dessa funktioner möjliggör multiplexing med 2-D Fluorescens Elektrofores Skillnad Gel (2-D Dige) med Ettan Dige teknik och analys av förändringar proteinuttryck med DeCyder 2-D Differential analysprogram. Graden av proteiner på cellernas ytor följdes under serum svält i CHO celler för olika lång tid (se tabell 1). Små förändringar i överflöd upptäcktes med hög noggrannhet, och resultaten stöds av definierade statistiska metoder.
Proteinkoncentration
En översikt av de två märkning arbetsflöden visas i figur 1. Eftersom cellerna är fortfarande intakt när märkas enligt cellytan protein märkning protokoll, bara cellytan proteiner som utsätts för färgen. I standard Ettan Dige protokollet, de celler lyseras före märkning och proteiner såväl inom som utanför cellen är märkta (Fig. 1). Den relativa mängden färgämne till protein i cellen-ytprotein märkning-protokollet är inte känt, eftersom proteiner p?…
Vi tackar professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer och Sigurd Krieger vid institutionen för klinisk patologi, universitetet i Wien, Österrike för deras samarbete.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |