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Tri des cellules activées magnétiques (MACS)
 

Tri des cellules activées magnétiques (MACS) : isolement des lymphocytes T thymiques

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Le tri des cellules activées par magnétique, ou MACS, est une technique qui permet aux chercheurs de séparer les cellules en fonction d'épitopes spécifiques exprimées sur leurs surfaces.

Le processus commence généralement par l'extraction d'un organe ou d'un tissu, comme le thymus. Ensuite, les cellules sont séparées mécaniquement, généralement par concassage, jusqu'à ce que le tissu soit dissocié en cellules simples. Les cellules indésirables peuvent être enlevées à ce stade par l'ajout de produits chimiques. Par exemple, l'ammonium-chlorure-potassium, ou tampon ACK, peut être utilisé pour lyser les érythrocytes indésirables.

Ensuite, un anticorps conjugué à une molécule appelée biotine est ajouté à la suspension, et ces complexes se lient aux épitopes de la surface des cellules cibles. La biotine a une forte affinité pour une autre molécule appelée streptavidine. Dans l'étape suivante, des molécules de streptavidin fusionnées aux perles magnétiques sont ajoutées aux cellules étiquetées d'anticorps. Lorsque la biotine et la streptavidine entrent en contact, elles se lient étroitement. Le résultat est que les cellules d'intérêt sont recouvertes de perles magnétiques. Ce complexe est parfois appelé un sandwich. Dans ce cas, CD3 sur la membrane cellulaire sur le fond, puis anti-CD3 conjugué à la biotine, et enfin, streptavidin conjugué à des perles magnétiques.

Ces cellules étiquetées peuvent maintenant être placées dans une colonne contenant une matrice qui, assistée par la gravité, permet aux cellules de passer lentement par un aimant. Ce faisant, les cellules étiquetées par perles magnétiques colleront au bord du tube le plus proche de l'aimant, tandis que les cellules non étiquetées continueront dans un tube de collecte ci-dessous. Ensuite, les cellules étiquetées peuvent être retirées de la colonne en enlevant simplement l'aimant, en ajoutant une solution d'éluence, et en appliquant une pression douce avec un piston pour les rincer hors de la colonne et dans un tube de collecte frais. En fin de compte, ce processus permet de récupérer de 60 à 98 % les cellules d'intérêt.

Dans cette procédure, nous allons isoler les leucocytes thymiques d'une souris et utiliser MACS pour trier les lymphocytes T CD3-positifs avant de confirmer l'efficacité du tri à l'aide de FACS.

Pour commencer, mettez tout équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, lavez une paire de ciseaux et de forceps disséquants avec 70 % d'éthanol et séchez-les avec un essuie-tout propre. Préparez ensuite 200 millilitres de sérum fœtal de veau HBSS 2%, ou FCS, en mélangeant quatre millilitres de FCS avec 196 millilitres de HBSS.

Épingler une souris euthanasiée en position de supine sur une plaque de dissection. À l'aide de ciseaux et de forceps, effectuer une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique. Tout d'abord, enlever le cœur pour accéder au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Ensuite, identifiez le thymus, qui est composé de deux lobes blancs. À l'aide de forceps, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur un plat Petri avec cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Pour isoler les cellules immunitaires, placez d'abord le thymus sur une passoire à cellules de 40 micromètres dans le plat Petri. Écraser le tissu à l'œil d'un piston pour le dissocier dans le plat. Après cela, rincer le piston et la passoire avec HBSS 2% FCS pour récupérer toutes les cellules adhérées. Ensuite, pipette les cellules de thymus dissociés et le liquide de la vaisselle Petri dans un tube centrifugeur de 15 millilitres. Laver le plat Petri avec cinq millilitres de HBSS 2% FCS et transférer cette solution de lavage à la centrifugeuse de 15 litres tube également.

Ensuite, centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille en deux millilitres de tampon de lysing ACK pour lyser les érythrocytes. Incuber pendant deux minutes à température ambiante sur le dessus du banc. Ensuite, porter le volume à 14 millilitres avec HBSS 2% FCS. Centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, jetez le supernatant et resuspendre les cellules en cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Estimer la concentration cellulaire à l'aide d'une diapositive Malassez comme le montre le protocole pour l'isolement FACS des lymphocytes B et ajuster la concentration cellulaire à 10 à la septième cellule par millilitre avec HBSS 2% FCS.

Transférer 500 microlitres de solution cellulaire dans deux tubes FACS. Étiqueter un tube de lymphocytes T non enrichis et les autres lymphocytes T enrichis par tube, qui seront séparés à l'aide de l'étiquetage magnétique.

Centrifuger le tube enrichi de lymphocytes T à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 microlitres de biotine couplée anticorps anti CD3 dilué un sur 400 dans HBSS 2% FCS. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur la glace et dans l'obscurité. Ajouter trois millilitres de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 microlitres de perles couplées à la streptavidine diluées une sur cinq dans LE HBSS 2% FCS. Incuber le mélange de cellules et de perles pendant 20 minutes sur la glace. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS au tube, pipette de haut en bas pour mélanger, et centrifugeuse à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Resuspendre la pastille en deux millilitres de HBSS 2% FCS.

Placez la colonne sur l'aimant et ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS pour humidifier le système. Ensuite, pipette les cellules tachées dans la colonne. Après que la suspension de cellule passe par la colonne, lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de HBSS 2% FCS. Ensuite, retirez la colonne de l'aimant et placez-la dans un tube de 15 millilitres. Pour éliner les cellules cibles, ajouter cinq millilitres de HBSS 2% FCS à la colonne et rincer la colonne avec un piston. Répétez cette étape avec un autre cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Pour évaluer l'efficacité de l'isolement cellulaire cible, transférez d'abord 500 microlitres de suspension de cellules élucées à un tube FACS et étiquetez-le enrichi t-cells. Ensuite, centrifuger les tubes enrichis et non enrichis à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant, puis ajouter 100 microlitres d'anticorps fluorescents dilués un sur 200 dans HBSS 2% FCS aux deux tubes. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur la glace et dans l'obscurité. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS aux tubes et centrifugez-les à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant, puis resuspendre les granulés dans 250 microlitres de HBSS 2% FCS. Maintenant, évaluez le taux d'enrichissement cellulaire CD3-positif utilisant la cytométrie de flux comme indiqué dans le protocole FACS.

Maintenant, nous allons déterminer la fréquence des lymphocytes CD3-positifs parmi tous les thymocytes qui ont été isolés du thymus de souris. Pour commencer, cliquez deux fois sur l'icône FlowJo et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre de l'échantillon. Ensuite, double clic sur le fichier de lymphocytes T enrichis pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l'avant, FSCA, sur l'axe X, et la diffusion latérale, SSCA, sur l'axe y.

Cliquez sur le polygone pour faire le tour des populations de lymphocytes. Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez FSC-W sur l'axe y, et FSC-A sur l'axe X et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez votre population cellulaire Cellules uniques. Ensuite, cliquez sur OK sur la fenêtre d'identification de la sous-population, puis double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez CD3 sur l'axe y et encerclez les cellules CD3-positives. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez vos lymphocytes T de la population cellulaire. Répétez l'opération avec le fichier de lymphocytes T non enrichis. Pour visualiser votre population cellulaire, cliquez sur Layout Editor et faites glisser la population de lymphocytes T à partir de lymphocytes T enrichis et de fichiers De lymphocytes T non enrichis dans l'onglet.

Des parcelles de points représentant des lymphocytes cD3-positifs apparaîtront. Les cellules CD3-positives devraient seulement apparaître dans la population d'intérêt dans le tube enrichi CD3-positif. Pour évaluer l'enrichissement des lymphocytes positifs CD3 dans les cellules triées, cliquez sur l'éditeur de table, puis faites glisser la population de lymphocytes T à partir de lymphocytes T enrichis et de fichiers de lymphocytes T non enrichis dans le tableau. Sur le menu statistique, sélectionnez Fréquence des cellules lymphocytes pour vérifier le pourcentage de cellules CD3-positives dans tous les lymphocytes. Ensuite, cliquez sur Créer la table. Les valeurs de paramètres apparaîtront dans un nouveau tableau. Pour les lymphocytes T enrichis, la fréquence des cellules CD3-positives devrait être d'environ 80% ou au-dessus.

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