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磁気活性化細胞選別(MACS):胸腺Tリンパ球の単離

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磁気活性化細胞選別(MACS)は、研究者が表面に発現する特定のエピトープに基づいて細胞を分離することを可能にする技術です。

プロセスは、通常、胸腺などの器官または組織の抽出から始まる。次いで、細胞は機械的に分離され、通常は破砕によって、組織が単一細胞に解離されるまでである。不要な細胞は、化学物質の添加を介して、この段階で除去することができます。例えば、塩化アンモニウム-カリウム、またはACKバッファーは、不要な赤血球をlyseseに使用することができる。

次に、ビオチンと呼ばれる分子に結合した抗体を懸濁液に加え、これらの複合体が標的細胞の表面のエピトープに結合する。ビオチンは、ストレプトアビジンと呼ばれる別の分子に対して高い親和性を有する。次のステップでは、磁気ビーズに融合したストレプトアビジン分子を抗体標識細胞に添加する。ビオチンとストレプトアビジンが接触すると、それらはしっかりと結合します。その結果、目的の細胞は磁気ビーズでコーティングされます。この複合体は、サンドイッチと呼ばれることもあります。この場合、底部の細胞膜上のCD3は、次いで抗CD3をビオチンに結合し、最後に、ストレプトアビジンを磁気ビーズに結合させた。

これらの標識された細胞は、重力によって助けられ、細胞が磁石によってゆっくりと通過することを可能にするマトリックスを含む列に置くことができるようになりました。そうすると、磁気ビーズ標識細胞は磁石に最も近いチューブの端に付着し、非標識された細胞は下のコレクションチューブに続きます。次に、標識された細胞は、磁石を取り除き、溶出液を加え、プランジャーで穏やかな圧力をかけてカラムから新鮮な回収管に流し込むだけで、カラムから取り除くことができます。最終的に、このプロセスは、対象の細胞の60~98%の検索を可能にします。

この手順では、マウスから胸腺白血球を分離し、MACSを使用してCD3陽性T細胞を選別し、FACSを用いたソートの効率を確認する。

まず、ラボコートや手袋を含む適切な保護具を着用してください。次に、解剖はさみと鉗子を70%のエタノールで洗い、きれいなペーパータオルで乾かします。次に、4ミリリットルのFCSと196ミリリットルのHBSSを混合することにより、200ミリリットルのHBSS 2%胎児子牛血清、またはFCSを調製する。

解剖プレート上のスピネの位置に安楽死マウスをピン留めします。はさみと鉗子を使用して、胸腔にアクセスするために縦腹腔切り目を行う。まず、心臓の上に位置する胸腺へのアクセスを得るために心臓を削除します。次に、2つの白い葉で構成される胸腺を識別します。鉗子を使用して、慎重に胸腺を取り外し、HBSS 2%FCSの5ミリリットルでペトリ皿の上に置きます。

免疫細胞を単離するには、まずペトリ皿の40マイクロメートルの細胞ストレーナーに胸腺を置きます。プランジャーでティッシュをつぶし、皿に解離します。この後、HBSS 2%FCSでプランジャーとストレーナーをすすいで、付着した細胞を回収します。次いで、解離された胸腺細胞および流体をペトリ皿から15ミリリットル遠心管にピペットする。5ミリリットルのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗い、この洗浄液を15ミリリットル遠心管に移します。

次に、20°Cで7分間、370回gでチューブを遠心分離します。上清を廃棄し、赤血球をlysesesASASAの2ミリリットルでペレットを再懸濁する。ベンチトップの室温で2分間インキュベートします。次に、HBSS 2% FCSで14ミリリットルにボリュームを持って来ます。20°Cで7分間、370回gでチューブを遠心分離します。次いで、上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5ミリリットルで細胞を再懸濁する。

Bリンパ球のFACS単離のためのプロトコルに示すようにマラセススライドを使用して細胞濃度を推定し、HBSS 2%FCSで1ミリリットル当たり10~7番目の細胞に細胞濃度を調整します。

500マイクロリットルのセル溶液を2つのFACSチューブに転送します。1つのチューブ非濃縮T細胞と他のチューブ濃縮T細胞に標識し、磁気標識を使用して分離するT細胞を濃縮する。

濃縮されたT細胞チューブを370倍gで遠心分離し、摂氏20度で3分間使用します。上清を廃棄し、250マイクロリットルのビオチン結合抗CD3抗体でペレットを再懸濁し、HBSS 2%FCSで400分の1を希釈した。氷の上と暗闇の中で20分間細胞をインキュベートします。チューブにHBSS 2%FCSの3ミリリットルを追加し、20°Cで3分間370回gで再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSで5分の1を希釈したストレプトアビジン結合ビーズの250マイクロリットルでペレットを再懸濁する。細胞とビーズの混合物を氷上で20分間インキュベートします。次に、HBSS 2%FCSの3ミリリットルをチューブに加え、上下にピペットを混ぜ合わせ、20°Cで3分間370回gで遠心分離機を再び加えます。HBSS 2% FCSの2ミリリットルでペレットを再中断します。

磁石の上にカラムを置き、HBSS 2%FCSの3ミリリットルを加えてシステムを加湿させます。次いで、染色された細胞を柱にピペットする。セルサスペンションがカラムを通過した後、HBSS 2%FCSの3ミリリットルでカラムを3回洗浄します。次に、磁石からカラムを取り出し、15ミリリットルのチューブに入れます。標的細胞を溶出させるには、HBSS 2%FCSの5ミリリットルをカラムに追加し、カラムをプランジャーで洗い流します。HBSS 2% FCS の別の 5 ミリリットルでこの手順を繰り返します。

標的細胞単離の有効性を評価するために、まず500マイクロリットルのeluted細胞懸濁液をFACSチューブに移し、濃縮T細胞に標識する。次いで、濃縮チューブと非濃縮チューブの両方を370回gで20°Cで7分間遠心分離する。上清を廃棄し、次いで200分の1の蛍光抗体をHBSS2%FCSで200マイクロリットルの両管に添加する。氷の上と暗闇の中で20分間細胞をインキュベートします。次に、HBSS 2%FCSの3ミリリットルをチューブに加え、20°Cで3分間370回gで遠心分離します。上清を廃棄し、250マイクロリットルのHBSS 2%FCSでペレットを再懸濁させる。ここで、FACS プロトコルに示すようにフローサイトメトリーを使用して CD3 陽性細胞濃縮率を評価します。

次に、マウス胸腺から単離したすべての胸腺細胞の中でCD3陽性リンパ球の頻度を決定する。開始するには、FlowJo アイコンをダブルクリックし、すべてのサンプル ウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。次に、濃縮された T セル ファイルをダブルクリックして、そのサンプルから記録されたセルをドット プロットに表示し、X 軸上の前方散布図、FSCA、およびサイド スキャッタ(SSCA)を Y 軸に表示します。

ポリゴンをクリックしてリンパ球集団を円で囲みます。次に、円で囲まれた人口をダブルクリックして新しいウィンドウを作成します。Y 軸で FSC-W を選択し、X 軸で FSC-A を選択し、FSA-W 負のセルを丸で囲みます。サブ母集団識別ウィンドウで、セルの母集団に単一セルという名前を付けます。次に、サブ母集団識別ウィンドウで [OK] をクリックし、円で囲まれた母集団をダブルクリックして新しいウィンドウを作成します。Y 軸で CD3 を選択し、CD3 陽性セルを丸で囲みます。サブ母集団識別ウィンドウで、セル母集団に T セルに名前を付けます。非エンリッチト T セル ファイルを繰り返します。セルの母集団を視覚化するには、[レイアウト エディタ] をクリックし、エンリッチされた T セルファイルと非エンリッチ T セル ファイルから T セルの母集団をタブにドラッグします。

CD3陽性リンパ球を表すドットプロットが現れる。CD3陽性細胞は、CD3陽性濃縮チューブ内の対象の集団にのみ現れるべきである。ソートされた細胞におけるCD3陽性リンパ球の濃縮を評価するには、テーブルエディタをクリックし、濃縮されたT細胞および非濃縮T細胞ファイルからT細胞母集団をテーブルにドラッグします。統計メニューで、[リンパ球細胞の頻度]を選択して、すべてのリンパ球におけるCD3陽性細胞の割合を確認します。次に、[テーブルの作成] をクリックします。パラメータ値が新しいテーブルに表示されます。濃縮されたT細胞の場合、CD3陽性細胞の頻度は約80%以上である必要があります。

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