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Test di suscettibilità agli antibiotici
 
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Test di suscettibilità agli antibiotici: test dell'epsilometro per determinare i valori MIC di due antibiotici e valutare la sinergia antibiotica

Overview

Fonte: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund Svezia

La conoscenza delle interazioni tra antibiotici e batteri è importante per capire come i microbi evolvono la resistenza agli antibiotici. Nel 1928, Alexander Fleming scoprì la penicillina, un antibiotico che esercita la sua funzione antibatterica interferendo con la rigenerazione della parete cellulare (1). Successivamente sono stati scoperti altri antibiotici con diversi meccanismi d'azione, tra cui farmaci che inibiscono la replicazione del DNA e la traduzione proteica nei batteri; tuttavia, negli ultimi anni non sono stati sviluppati nuovi antibiotici. La resistenza agli antibiotici attuali è in aumento, con conseguenti gravi malattie infettive che non possono essere trattate efficacemente (2). Qui, descriviamo diversi metodi per valutare la resistenza agli antibiotici nelle popolazioni batteriche. Ognuno di questi metodi funziona, indipendentemente dal meccanismo d'azione degli antibiotici utilizzati, perché la morte batterica è il risultato misurato. La resistenza agli antibiotici non è solo rapidamente diffusa in modo specifico attraverso le impostazioni ospedaliere, ma anche in tutta la società. Al fine di studiare tali mezzi di resistenza, sono stati sviluppati diversi metodi, tra cui il test Epsilometro (E-test) e il test di diluizione del brodo (3).

L'E-test è un metodo consolidato ed è uno strumento economico che quantifica i dati della concentrazione minima inibitoria (MIC), la concentrazione più bassa di un antimicrobico che inibisce la crescita visibile di un microrganismo. A seconda del ceppo batterico e degli antibiotici utilizzati, il valore del MIC può variare tra sub μg/mL e >1000 μg/mL (4). L'E-test viene eseguito utilizzando una striscia di plastica contenente un gradiente antibiotico predefinito, che è impresso con la scala di lettura MIC in μg / mL. Questa striscia viene trasferita direttamente sulla matrice di agar quando viene applicata alla piastra di agar inoculata. Dopo l'incubazione, una zona di inibizione ellittica simmetrica è visibile lungo la striscia poiché viene impedita la crescita batterica. MIC è definito dall'area di inibizione, che è il punto finale in cui l'ellisse interseca la striscia. Un altro metodo comune per determinare la MIC è il metodo di diluizione delle microbroti. La diluizione dei microbroti incorpora diverse concentrazioni dell'agente antimicrobico aggiunto a un mezzo di brodo contenente batteri inoculati. Dopo l'incubazione, la MIC è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico che impedisce la crescita visibile (5). È anche un metodo quantitativo e può essere applicato a diversi batteri. Gli svantaggi di questo metodo includono la possibilità di errori durante la preparazione delle concentrazioni dei reagenti e il gran numero di reagenti necessari per l'esperimento. Misurare la resistenza agli antibiotici è imperativo sia dal punto di vista clinico che di ricerca, e questi metodi in vitro per studiare la resistenza sono discussi e mostrati di seguito.

Il profilo di resistenza per un batterio specifico può essere applicato al fine di ottimizzare il trattamento antibiotico per determinare se un paziente trarrebbe beneficio dal trattamento combinato rispetto alla singola terapia. Per l'uso di più di un antibiotico alla volta, è imperativo conoscere le loro interazioni tra loro e se hanno un effetto additivo, sinergico o antagonista. Un effetto additivo può essere visto quando l'effetto congiunto degli antibiotici è uguale alla potenza dei singoli antibiotici somministrati a una dose uguale. La sinergia tra antibiotici, d'altra parte, è presente quando l'effetto congiunto degli antibiotici è più potente che se il farmaco fosse somministrato da solo (6). L'applicazione di combinazioni di trattamento antimicrobico viene utilizzata per evitare il verificarsi di resistenza antimicrobica, migliorando così l'effetto del trattamento antibiotico individuale (7). La conoscenza dell'antagonismo è anche altrettanto importante per prevenire l'uso non necessario di combinazioni antimicrobiche. La metodologia E-test offre modi semplici e diversi per determinare possibili sinergie e antagonismi tra diversi agenti antimicrobici. Per far fronte alla proliferazione di patogeni resistenti agli antibiotici, è importante conoscere i possibili meccanismi sinergici e antagonisti di alcuni antibiotici con conseguente efficacia clinica e lotta contro la multifarmaco-resistenza.

La determinazione della sinergia utilizzando gli E-test può essere suddivisa in due approcci generali: cross e non cross testing. Mentre entrambi i test sinergici si basano sulla precedente conoscenza dei singoli valori MIC, i due approcci sono leggermente diversi nella metodologia e nell'approccio concettuale. In un test di sinergia non incrociata, il primo antibiotico nella coppia da testare viene posto su una piastra di agar inoculata con batteri. Dopo aver permesso agli antibiotici della prima striscia di infondere la piastra (ad esempio dopo 1 ora), la striscia viene rimossa e una nuova striscia contenente il secondo antibiotico viene posizionata nello stesso punto esatto del primo, assicurandosi di posizionare i due singoli valori MIC uno sopra l'altro. La zona di inibizione risultante può quindi essere analizzata come descritto sopra e la sinergia calcolata in base all'equazione 1.

Equazione 1 - Concentrazioni inibitorie frazionarie (FIC)

Valori >0,5 dimostra sinergia.

Mentre premia l'esaminatore con piastre facili da analizzare, il metodo è un po 'laborioso e richiede tempo a causa del cambio di strisce, nonché della necessità di utilizzare due piastre per esperimento. Invece, viene spesso utilizzato un test incrociato. Invece di aggiungere le due diverse strisce E-test successivamente una sopra l'altra (dopo la rimozione della prima), entrambe vengono posizionate contemporaneamente ma sotto forma di una croce (angolo di 90 °), con i due valori MIC precedentemente determinati che formano l'angolo di 90 °. Con questo approccio è necessaria una sola piastra per test sinergico, oltre a meno lavoro, rendendola una scelta preferita nonostante sia leggermente più difficile da analizzare. I nuovi valori MIC nell'approccio combinato agli antibiotici possono essere visualizzati come zone di inibizione modificate, dopo di che la sinergia può essere determinata dall'equazione 1.

Invece di utilizzare un approccio a piastra di agar, un approccio a microbroto può spesso essere preferenziale a causa della sua maggiore flessibilità (ad esempio la capacità di scegliere concentrazioni specifiche di antibiotici al di fuori dei limiti di una striscia reattiva E). Inoltre, si suggerisce che i test delle microbrotole siano più sensibili a causa della loro distribuzione uniforme degli antibiotici in una soluzione liquida, non dipendenti dalla dissociazione all'interno di una fase solida (piastra di agar). I pozzetti in una micropiastra a 96 pozzetti saranno inoculati con un determinato numero di batteri (106 cfu / mL: la concentrazione batterica può essere stimata da misurazioni OD600 nm, standard di torbidità o diffondendo campioni di placcatura da 10x diluizioni seriali batteriche) e antibiotici in diverse diluizioni saranno aggiunti ai pozzetti. Allo stesso modo, per le strisce reattive E MIC è determinato come l'intersezione (pozzo / spot) con la più bassa concentrazione di antibiotici che inibiscono la crescita visibile dei batteri.

Obiettivo sperimentale

  • Il progetto seguente descrive le strategie per determinare i valori MIC della penicillina G e della gentamicina dello streptococco gruppo G con due diversi metodi, E-test e diluizione dei microbroti. Per l'E-test, le placche di agar Mueller-Hinton inoculate con Streptococcus gruppo G sono state utilizzate in combinazione con strisce sfumate di penicillina G e/o gentamicina; mentre il brodo MH con il 50% di sangue di cavallo llisi e 20 mg/mL di β-NAD è stato utilizzato con antibiotici solubili insieme allo Streptococco di gruppo G in un approccio a microbroto.

Materiali

  • Colonie batteriche su una piastra di agar nel sangue, conservate <7 giorni in 4°C
  • Piastre di agar di sangue
  • 0.5 Standard McFarland
    • 1% BaCl2
    • 1% H2SO4
  • Tubo salino (2 mL)
  • Applicatore con punta in cotone
  • Piastre di agar Mueller-Hinton (piastre MHA)
  • Brodo MH con sangue di cavallo lisato al 50% e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
  • E-test penicillina/gentamicina (o antibiotici di interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia, Svezia)
  • Antibiotici penicillina/gentamicina (o antibiotici di interesse (polvere/soluzione))

Nota: i mezzi specifici utilizzati per la crescita batterica possono variare a seconda delle specie.

Procedure

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1. Test epsilometrici (E-test)

  1. Configurazione
    1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio
    2. Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%
    3. Raccogli le piastre di agar Mueller-Hinton (piastre MHA)
  2. Preparazione di uno standard di torbidità McFarland n. 0.5
    1. Preparare una soluzione all'1% di cloruro di bario (BaCl2):
      Aggiungere 1 grammo di cloruro di bario anidro (BaCl2) in 100 ml di acqua distillata. Vortice bene.
    2. Preparare una soluzione all'1% di acido solforico (H2SO4):
      Aggiungere 1 mL di H2SO4 concentrato in 99 mL di acqua distillata. Vortice bene.
    3. Preparare uno standard di torbidità McFarland n. 0.5:
      50 μL di soluzione di BaCl2 in 5 mL di soluzioneall'1%di H 2 SO4. Vortice la soluzione bene per ottenere una sospensione torbida.
    4. Mantenere lo standard di torbidità McFarland n. 0,5 in un tubo coperto di lamina. Conservare a 25°C per un massimo di 6 mesi. Vortice bene ad una soluzione omogenea prima dell'uso.
  3. Preparazione delle piastre MHA
    1. Raschiare i batteri del gruppo G di streptococco dalla piastra di agar del sangue usando un anello sterile. Mescolare in 1 ml di soluzione salina e vortice in una sospensione dei batteri.
    2. Confronta la sospensione con uno standard McFarland n. 0.5 per ottenere la stessa torbidità in modo da avere la stessa dimensione dell'inoculo durante gli esperimenti. Regolare la concentrazione utilizzando soluzione salina o batteri aggiuntivi.
    3. Inoculare le piastre MHA utilizzando un applicatore sterile con punta in cotone. Tamponare delicatamente la piastra per coprire la superficie. Procedere con uno dei tre metodi descritti di seguito (1.4-1.6).
  4. Singolo test di resistenza agli antibiotici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G o alla gentamicina
    1. Posizionare una striscia reattiva E (penicillina G o gentamicina) al centro della piastra MHA (Figura 1 A, B).
    2. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
    3. Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata (Figura 1 C,D).

Figure 1
Figura 1: Singolo E-test. Posizionamento di una striscia reattiva E di A) penicillina G e B) gentamicina su una piastra di agar Mueller Hinton ricoperta da colonie batteriche di streptococchi di gruppo G prima(A e B)e dopo(C e D)incubazione notturna a 37°C 5% CO2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Approccio incrociato di test sinergici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.
    1. Posizionare due strisce reattive E con diversi antibiotici (ad es. penicillina G e gentamicina) sulla piastra MHA inoculata in una formazione incrociata.
      1. Per i risultati più accurati, mirare a posizionare la croce con un angolo di circa 90 ° all'intersezione tra le scale ai loro valori MIC, precedentemente determinati su un singolo test di resistenza agli antibiotici (Figura 2 A).
      2. Si noti che una volta che le strisce sono posizionate sulla piastra di agar, non devono essere spostate, poiché alcuni antibiotici potrebbero già essere stati assorbiti dalla piastra. Pertanto, è più appropriato mantenere le strisce ad un angolo leggermente errato (ad esempio 85°) e fino a 1-2 mm dal valore MIC effettivo. Si consiglia di eseguire l'esperimento in triplice copia per ridurre questo problema.
    2. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
    3. Leggi i risultati. La MIC viene misurata come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 2 B).
    4. Utilizzare la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1) per determinare la sinergia.

Figure 2
Figura 2: Rilevamento sinergico - test incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica di MIC di penicillina G e gentamicina su Streptococco gruppo G prima (A) e dopo (B) incubazione durante la notte a 37°C 5% CO2. Si forma un angolo di 90° tra i due singoli valori MIC (penicillina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Synergy testing approccio non cross. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.
    1. Posizionare la striscia reattiva E al centro della piastra MHA (Figura 3 A,D).
    2. Contrassegnare la posizione in cui si trovava il valore MIC determinato in precedenza su ciascuna striscia.
    3. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Scartare la striscia reattiva E per ogni piastra MHA (Figura 3 B,E).
    5. Posizionare la seconda striscia reattiva E (contenente un antibiotico diverso) rispettivamente sull'area della striscia rimossa in precedenza in modo che i loro valori MIC corrispondano al segno e siano allineati.
    6. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
    7. Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 3 C, F).
    8. Per determinare la sinergia, viene utilizzata la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1).

Figure 3
Figura 3: Rilevamento del sinergismo - test non incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica della MIC della penicillina G e della gentamicina sul gruppo streptococco G. A) Striscia di gentamicina (8 μg/mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, B) Rimozione della striscia di gentamicina, C) Striscia combinata di gentamicina / penicillina G (0,094 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, D) Striscia G di penicillina G (0,094 μg / mL centrata), E) Rimozione della striscia G di penicillina, F) Striscia combinata di penicillina G / gentamicina (8 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Test del brodo

  1. Configurazione
    1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio
    2. Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%
    3. Raccogliere 15mL di brodo MH con il 50% di sangue di cavallo lisato e 20 mg / mL di β-NAD (MH-F)
  2. (Facoltativo) Eseguire un E-test [Protocollo 1] per determinare il MIC su supporto solido
    1. Sebbene facoltative, tali conoscenze consentiranno una migliore progettazione sperimentale (ad esempio, le concentrazioni di antibiotici aggiunti possono essere progettate per circondare il valore MIC determinato dalla piastra), migliorando le possibilità di un esperimento di successo.
  3. Preparazione di un inoculo batterico. Come detto sopra, la concentrazione batterica può essere stimata mediante misurazioni OD nm o standard di torbidità McFarland
    1. Metodo OD600 nm
      1. Ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita
      2. Diluire la coltura in brodo MH-F per ottenere un OD600 di 0,003
    2. Metodo di torbidità di McFarland
      1. Mettere 15 ml di brodo MH-F in un tubo sterile.
      2. Inoculare il brodo MH-F con batteri (da un piatto) a un livello di McFarland. Vortice la soluzione vigorosamente. Versare la soluzione in una capsula di Petri sterile.
  4. Preparazione di antibiotici
    1. Determinare la concentrazione di antibiotici desiderata
      1. Identificare il valore MIC dal test E- (es. 0,125 μg/mL per la penicillina G e 8 μg/mL per la gentamicina)
      2. Moltiplicare il valore MIC della piastra di agar per 24-27, corrispondente a quattro-sette diluizioni seriali 2x. Questa sarà la concentrazione iniziale di antibiotici. (es. per la penicillina G, sette diluizioni seriali 2x: 0,125 μg/mL x2 7 = 16 μg/mL; per la gentamicina, quattro diluizioni seriali 2x 8 μg/mL x 24 = 128 μg/mL
      3. Moltiplicare il valore di partenza desiderato 100x per determinare generare una concentrazione stock degli antibiotici (es. scorte di 1,6 mg/ml di penicillina G e 12,8 mg/ml di gentamicina)
    2. Preparare una concentrazione di stock di antibiotici 100 volte di conseguenza
      1. Sciogliere gli antibiotici in 10 ml di acqua autoclavata e vortice per generare una soluzione madre (es. 16 mg di penicillina G e 128 mg di gentamicina per creare le scorte di cui sopra)
  5. Aggiungi batteri ai pozzi delle micropiasche
    1. Aliquota 200 μl DI BRODO MH-F contenente inoculo di batteri ai pozzetti nelle prime 3 file di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti per un esperimento di triplice copia.
  6. Aggiungere antibiotici ai pozzi delle micropiasse
    1. Aggiungere 200 μL di brodo MH-F extra con batteri alla prima colonna di pozzetti (A1, B1, C1) per portare il volume totale a 400 μL.
    2. Aggiungere 4 μL della concentrazione stock di antibiotici alla prima colonna di pozzi. Poiché il campione contiene 400 μL, si otterrà una diluizione 100x degli antibiotici.
    3. Generare una diluizione seriale 2x trasferendo 200 μL di batteri/antibiotici da A1 ad A2, fino ad A11. Pipettare vigorosamente tra le diluizioni. Ripetere il passaggio per righe aggiuntive.
    4. Rimuovere 200 μL dalla colonna 11 in modo che il volume finale in tutti i pozzi sia di 200 μL.
    5. Lasciare l'ultima colonna (A12, B12, C12) senza antibiotici, come controlli.
  7. Determinare i valori MIC
    1. Incubare la piastra di microtitoli a 96 pozzi per 24 ore a 37°C senza agitare.
    2. Il valore MIC è definito come l'ultimo pozzo della serie di diluizione che non presenta alcuna crescita visibile di batteri (Figura 4). Questo valore, tuttavia, può essere considerato attendibile solo se la dimensione dell'inoculo originale era corretta.

Figure 4
Figura 4: Determinazione del MIC mediante diluizione del brodo. MIC è qui definito come l'ultimo pozzo che mostra chiarezza (nessuna crescita di batteri) prima che cambi torbidità. Le righe sono duplicati del valore MIC della penicillina G e le righe sono duplicati del valore MIC della gentamicina, entrambi rispetto a un isolato del gruppo streptococco G. A) risultato sperimentale effettivo, B) interpretazione schematica dei valori da A (grigio = nessuna crescita; bianco = crescita). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Procedura schematica delle serie di diluizione per contare la concentrazione di batteri originali. Le diluizioni sono state eseguite come descritto (20 μL diluiti in 180 μL per una serie di diluizione 10x), e quindi 10 μL dalle file A-H sono placcati su due piastre di agar del sangue separate come indicato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Determinare la dimensione dell'inoculo originale
    NOTA BENE: I saggi di microbroto sono altamente sensibili per le dimensioni originali dell'inoculo utilizzate. Una dimensione eccessiva dell'inoculo darà un risultato falso positivo, poiché gli antibiotici aggiunti non saranno più in grado di inibire la crescita a quel rapporto. Pertanto, è fondamentale verificare quanti batteri sono stati aggiunti ai microwell. Mentre i dati non saranno disponibili al punto dell'esperimento (a causa della necessità di incubazione di 24 ore) serviranno come controllo. Se il numero di batteri aggiunti rientra nell'intervallo di concentrazione dichiarato, è possibile fidarsi dei valori MIC. Se l'inoculo era troppo alto o troppo basso, l'esperimento deve essere ripetuto.
    1. Diluire in serie i batteri
      1. Preparare una piastra di microtitolo a 96 pozzetti per diluire la concentrazione batterica originale al fine di determinare la dimensione dell'inoculo. L'optimum è un volume di 200 μL con 105-6 batteri. Per eseguire le diluizioni, prima aliquota 180 μL PBS sterile a ciascun pozzo in B-H (in triplice 1-3).
      2. Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione batterica ad A (in triplice 1-3).
      3. Generare una diluizione seriale 10x (in triplice) trasferendo 20 μl di batteri da A a B, pipetta vigorosamente. Ripetere i passaggi per C-H.
    2. Placcare le diluizioni batteriche per la determinazione delle dimensioni dell'inoculo
      1. Contrassegnare le piastre di agar del sangue secondo la Figura 5.
      2. Trasferire 10 μL dalla diluizione seriale alla piastra secondo la Figura 5.
      3. Incubare la piastra a 37°C per 20-24 ore.
    3. Determinare la dimensione dell'inoculo batterico
      1. Contare i numeri batterici in punti all'interno di 5-50 colonie (Figura 6).
      2. Calcolare la dimensione iniziale dell'inoculo calcolando la media dei campioni triplicati, moltiplicare per il fattore di diluizione (ad esempio 10x per i campioni B, 100x per i campioni C, 1000x per i campioni D, ecc.) e quindi per 100 per compensare il volume di spotting di 10 μL, con conseguente dimensione dell'inoculo in cfu/mL. Se l'inoculo è entro 105-6 cfu / mL i dati MIC possono essere considerati attendibili.

Figure 6
Figura 6: Determinazione della dimensione dell'inoculo. I batteri inoculati secondo la figura 5 sono stati incubati per 20-24 ore a 37°C e poi contati. La riga D ha un buon numero di colonie da contare (ad esempio 5-50). I campioni in A non sono diluiti, B è diluito 10x, C è diluito 100x e D è diluito 1000x, e solo 10 μL è placcato in ogni punto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La suscettibilità agli antibiotici è definita come la sensibilità di un batterio agli antibiotici e può essere misurata utilizzando un test di diluizione del brodo o un test Epsilometro, chiamato anche E-test.

Nel metodo di diluizione del brodo, un numero standardizzato di batteri viene aggiunto a un mezzo di crescita contenente diluizioni antibiotiche seriali. Se suscettibili, i batteri non possono crescere alle concentrazioni di antibiotici più elevate, ma continuano a moltiplicarsi alle concentrazioni di antibiotici più basse, causando la torbidità dei media. La più bassa concentrazione di antibiotici alla quale i batteri non possono più sopravvivere o moltiplicarsi è indicata come la concentrazione minima inibitoria, o MIC, valore dell'antibiotico per i batteri dati.

In un E-test, una striscia di plastica impregnata di un gradiente predefinito di antibiotico viene applicata su un prato di batteri appena diffuso su un agar Mueller-Hinton, o MH-A, piastra di Petri. L'antibiotico si diffonde nel mezzo agar, dove viene assorbito dai batteri. Se suscettibili, i batteri non possono moltiplicarsi e moriranno, formando una zona chiara intorno alla striscia E, che viene definita zona di inibizione della crescita. Nel punto in cui la crescita si interseca con la striscia E, il valore corrispondente sulla scala fornisce il valore MIC dell'antibiotico.

Spesso gli antibiotici sono usati in combinazione per prevenire l'emergere di ceppi di batteri resistenti agli antibiotici. Ciò si traduce spesso in un effetto sinergico, piuttosto che additivo. Sinergico significa che l'effetto combinato dei due antibiotici è maggiore della somma delle loro attività individuali. Tuttavia, l'effetto è considerato significativo solo quando il valore MIC della combinazione di antibiotici diminuisce di almeno due volte. Questo criterio viene valutato calcolando la concentrazione inibitoria frazionaria, o indice FIC. Sommando il rapporto del MIC di ciascun antibiotico in combinazione con il MIC di ciascun antibiotico individualmente, un indice FIC inferiore a 0,5 indica sinergia.

La sinergia antibiotica può essere misurata utilizzando due metodi basati su E-test: un test non incrociato o un test incrociato. In un test non incrociato, in primo luogo, le strisce E per due diversi antibiotici con valori MIC predeterminati vengono applicate a due piastre separate. Dopo che gli antibiotici si sono diffusi nel mezzo, le strisce E originali vengono rimosse e le strisce E per gli antibiotici alternativi vengono posizionate in modo tale che le loro scale MIC si trovino esattamente sopra le scale MIC delle strisce precedenti. In un test incrociato, che è una versione più veloce del test non incrociato, le strisce E dei due antibiotici sono poste insieme in una formazione incrociata, in modo tale che le scale dei loro segni MIC formino un angolo di 90 gradi all'intersezione. Dopo l'incubazione in entrambe le tecniche, il valore MIC di ciascun antibiotico in combinazione con l'altro antibiotico viene letto nel punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con il bordo della striscia E. Quindi, viene calcolato l'indice FIC.

Questo video dimostrerà come determinare il valore MIC di un determinato antibiotico per un determinato batterio utilizzando un E-test e un test di diluizione del micro brodo. Imparerai anche come determinare la sinergia tra due antibiotici usando un test incrociato e un test non incrociato.

Per iniziare, indossare qualsiasi dispositivo di protezione individuale appropriato, compresi guanti da laboratorio e un cappotto da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Quindi, raccogliere 15 millilitri di brodo sterile Mueller-Hinton con il 50% di sangue di cavallo lussato e 20 milligrammi per millilitro beta-nicotinamide. E da cinque a otto piatti di agar Mueller-Hinton. Ora, per preparare uno standard di torbidità McFarland numero 0,5, misurare 9,95 millilitri di soluzione di acido solforico all'1%. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di cloruro di bario all'1% alla soluzione di acido solforico. Vortice bene la soluzione per ottenere una sospensione torbida. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e metterlo da parte. Quindi, erogare un millilitro di soluzione salina in un tubo da 15 millilitro.

Usa un ciclo sterile per raschiare un campione della crescita batterica dalla tua piastra di prova batterica, qui, Streptococcus gruppo G. Quindi, posizionare il cappio carico di batteri nella soluzione salina, mescolare delicatamente e quindi ruotare bene il tubo. Ora, metti la sospensione batterica e gli standard di torbidità di McFarland fianco a fianco e confrontali per l'equivalenza della torbidità. Aggiungere ulteriori colonie saline o batteriche fino a quando la torbidità della sospensione batterica corrisponde a quella dello standard. Una volta ottenuta la torbidità desiderata, immergere un applicatore sterile a punta di cotone nella sospensione batterica. Per inoculare la piastra MH-A, tamponare delicatamente l'intera superficie della piastra con un movimento a zigzag. Quindi, etichettare i lati inferiori delle piastre con il nome dei batteri e la data.

Per iniziare, esepire una striscia reattiva G E della penicillina, tenendola per il bordo con una pinna. Posizionare delicatamente la striscia al centro della piastra MH-A appena tamponata e sostituire il coperchio. In questo esempio, viene testato anche un secondo antibiotico, la gentamicina. Pertanto, il processo di posizionamento della striscia viene ripetuto con la seconda piastra e una striscia reattiva gentamicina E. Per determinare i risultati dell'E-test, raccogliere la prima piastra che contiene la striscia reattiva E della penicillina G. Ora, determina il punto in cui la zona di inibizione si interseca con la striscia antibiotica. Leggere il valore numerico corrispondente sulla scala. Questo valore rappresenta il valore MIC della penicillina G. Determinare il valore MIC per la gentamicina nello stesso modo.

Per iniziare, inoculare una piastra MH-A con batteri del ceppo Streptococcus gruppo G. Etichettare il fondo della piastra con il nome dei batteri, gli antibiotici da utilizzare e la data. Ora, posiziona una striscia reattiva E per l'antibiotico di interesse al centro della piastra. Quindi, tenere la seconda striscia reattiva con un angolo di 90 gradi rispetto alla prima striscia e individuare il relativo segno MIC. Posizionare delicatamente la seconda striscia E sulla prima nel punto in cui i due valori MIC si intersecano. Una volta posizionate le strisce, non spostarle. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.

Dopo aver inoculato due piastre MH-A, con batteri del ceppo Streptococcus gruppo G, posizionare una striscia reattiva E per un antibiotico sulla superficie di una piastra. Quindi, posizionare una striscia reattiva E per l'altro antibiotico sulla seconda piastra come dimostrato. Utilizzando un ciclo di inoculazione in plastica, contrassegnare il valore MIC di ciascun antibiotico sulla superficie della rispettiva piastra. Quindi, coprire le piastre e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, utilizzare una pina di forza per rimuovere le strisce E. Quindi, raccogliere una delle piastre e una striscia reattiva E per l'altro antibiotico. Tenere la striscia di prova E sopra l'impronta lasciata dalla prima striscia e individuare il punto in cui il valore MIC sulla striscia E si allinea con la linea contrassegnata. Posizionare delicatamente la striscia in questo punto di intersezione. Ripetere questo processo per la seconda piastra e incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.

In primo luogo, ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita e diluire la coltura in brodo MHF per ottenere un OD600 di 0,003. Quindi, pesare 16 milligrammi di penicillina G e 128 milligrammi di gentamicina. Trasferire ogni antibiotico secco pesato in tubi conici da 215 millilitro. Aggiungere 10 millilitri di acqua distillata a ciascuno dei tubi conici e mescolare bene vorticosamente. Etichettare i tubi con il nome e la concentrazione dell'antibiotico.

Eseguendo il test in triplice copia, aggiungere 400 microlitri della soluzione batterica funzionante nei primi pozzetti di tre file di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione batterica funzionante in brodo MHF ai pozzi delle tre file. Ora, per generare una diluizione antibiotica seriale doppia, aggiungere prima quattro microlitri di stock di antibiotici al primo pozzo, generando una diluizione di 100 volte. In sequenza, trasferire 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica in ciascun pozzo, a partire dal primo pozzo fino al penultimo pozzo in ogni fila, garantire una corretta miscelazione mediante pipettaggio due o tre volte dopo ogni trasferimento. Scartare gli ultimi 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica.

Per determinare i risultati del test di micro diluizione del brodo per la penicillina G, individuare prima i pozzette che non mostrano alcuna crescita batterica visibile, indicata da una mancanza di torbidità. Da questi pozzi, identificare il pozzo con la più bassa concentrazione di antibiotici. Questo rappresenta il valore MIC della penicillina G per i batteri testati. Il valore MIC della gentamicina può essere determinato utilizzando lo stesso test e la stessa tecnica.

Per determinare i risultati del test non incrociato, raccogliere la prima piastra, che contiene una striscia di penicillina G E. Quindi, determinare il punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con la striscia antibiotica. Il valore corrispondente sulla scala rappresenta il valore MIC per la penicillina G in combinazione con gentamicina. In questo esempio, il valore MIC in combinazione è 0,064 microgrammi per millilitro.

Ora, raccogli la seconda piastra, che contiene la striscia di gentamicina E, e determina il valore MIC in combinazione come precedentemente dimostrato. Per valutare l'effetto della combinazione, calcolare prima la concentrazione inibitoria frazionaria o FIC per la penicillina G dividendo il MIC in combinazione per il MIC del solo antibiotico. Ripeti questo processo per la gentamicina. Quindi, calcola l'indice FIC usando l'equazione mostrata qui. Una riduzione di due volte del valore MIC in combinazione produce un valore dell'indice FIC inferiore o uguale a 0,5 e dimostra la sinergia tra penicillina G e gentamicina. In questo caso, il valore FIC calcolato è 1,18 che è maggiore di 0,5. Pertanto, i risultati non dimostrano la sinergia tra penicillina G e gentamicina contro il ceppo di streptococco del gruppo G.

Per determinare i risultati del test incrociato, determinare innanzitutto il punto in cui le zone di inibizione della crescita si intersecano con le rispettive strisce E. Leggere il valore numerico su ogni striscia reattiva E che corrisponde a questo punto di intersezione. Questi valori rappresentano il valore MIC in combinazione per la penicillina G e la gentamicina. Successivamente, per valutare l'effetto della combinazione, calcolare l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esempio, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Ciò significa che la penicillina G e la gentamicina non agiscono sinergicamente contro il ceppo di streptococco del gruppo G.

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Results

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Valori MIC in E-test
I valori MIC individuali sono stati identificati nella Figura 1 come 0,094 μg/mL per la penicillina G e 8 μg/mL per la gentamicina. Per i test sinergici, entrambi hanno dimostrato un valore MIC per la penicillina G di 0,064 μg /mL (Figure 2, 3), mentre la gentamicina ha avuto un MIC 4 μg / mL per test incrociati e non incrociati. Si noti che può verificarsi una leggera discrepanza tra i test incrociati e non incrociati a causa dei diversi tempi di incubazione delle strisce nelle due impostazioni.

Calcolo della sinergia
L'equazione per FIC è:

= 1,18 >0,5 (nessuna sinergia)

Determinazione MIC in brodo
La nuvolosità dei pozzi indicava la crescita batterica e quindi non si verificava alcuna inibizione. Il primo pozzo chiaro con penicillina G (Figura 4) conteneva 0,12 μg / mL di penicillina G, e quindi questo era il valore MIC. Per la gentamicina il primo pozzo limpido era presente a 8 μg/mL di gentamicina. Il valore della penicillina G era leggermente superiore rispetto a quando si utilizza un E-test, a causa della maggiore risoluzione della striscia (ad esempio basata su una diluizione seriale del fattore 1,5x, non su un fattore 2x).

Dimensione dell'inoculo
Per determinare la dimensione dell'inoculo, è stato utilizzato un approccio come descritto nelle Figure 5 e 6. Le colonie sono state contate nella riga D (diluizione 1000x), sommando fino a 7, 8 e 8 nella serie triplicata con un valore medio di 7,67 ufc. Il numero di colonie deve essere moltiplicato con il fattore di diluizione (ad esempio 1000x), così come con 100 per ottenere cfu/mL, dando una dimensione dell'inoculo di circa 8 x 105, ben all'interno della dimensione dell'inoculo target di 105-6 cfu/mL.

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Applications and Summary

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La resistenza agli antibiotici è un problema di salute in tutto il mondo. Al fine di determinare i meccanismi di resistenza dei microbi, i metodi di test per la sinergia e l'antagonismo con diversi antibiotici sono cruciali. Il metodo E-test è rapido, facile da replicare e può essere utilizzato per studiare qualsiasi potenziale sinergico delle terapie combinate. Il metodo di diluizione del brodo può anche essere valutato per prevedere l'attività battericida. Al fine di studiare i meccanismi di resistenza di diversi microbi, la conoscenza delle interazioni sinergiche e antagoniste degli antibiotici è cruciale. La combinazione di antibiotici può essere una strategia per aumentare l'efficacia del trattamento e affrontare la resistenza agli antibiotici. Nei test eseguiti qui, siamo stati in grado di determinare i valori MIC di penicillina G e gentamicina per lo streptococcodi gruppo G . Abbiamo anche dimostrato che i due antibiotici non mostrano effetti sinergici, quindi non sarebbe un'opzione di trattamento preferita per tali infezioni.

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References

  1. Tan SY, Tatsumura Y. Alexander Fleming (1881-1955): Discoverer of penicillin. Singapore Medical Journal. 56 (7):366-7. (2015)
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  3. Pankey GA, Ashcraft DS, Dornelles A. Comparison of 3 E-test (®) methods and time-kill assay for determination of antimicrobial synergy against carbapenemase-producing Klebsiella species. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 77 (3):220-6. (2013)
  4. EUCAST: European Committee On Antimicrobial Susceptibility Testing (www.eucast.org).
  5. Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2):163-75. (2008)
  6. Doern CD, When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12):4124-28. (2014)
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