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Antibiotika-Anfälligkeitstest: Epsilometer-Tests zur Bestimmung der MIC-Werte von zwei Antibiotika und zur Bewertung der Antibiotika-Synergie

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Die Antibiotikaanfälligkeit ist definiert als die Empfindlichkeit eines Bakteriums gegenüber Antibiotika und kann mit einem Brühverdünnungstest oder einem Epsilometer-Test, auch E-Test genannt, gemessen werden.

Bei der Brühenverdünnungsmethode wird einem Wachstumsmedium, das serielle Antibiotikaverdünnungen enthält, eine standardisierte Anzahl von Bakterien zugesetzt. Wenn anfällig, können die Bakterien nicht mit den höheren Antibiotikakonzentrationen wachsen, sondern weiterhin mit den niedrigeren Antibiotika-Konzentrationen vermehren, wodurch Medien trüb werden. Die niedrigste Antibiotikakonzentration, bei der die Bakterien nicht mehr überleben oder sich vermehren können, wird als minimaler hemmender Wert oder MIC-Wert des Antibiotikums für die gegebenen Bakterien bezeichnet.

In einem E-Test wird ein mit einem vordefinierten Antibiotikagradienten imprägnierter Kunststoffstreifen über einen frisch verteilten Rasen von Bakterien auf einen Mueller-Hinton-Agar oder MH-A, Petriplatte, aufgetragen. Das Antibiotikum diffundiert in die Agarmedien, wo es von den Bakterien aufgenommen wird. Wenn anfällig, die Bakterien können sich nicht vermehren und sterben ab, bilden eine klare Zone um den E-Streifen, die als Wachstumshemmungszone bezeichnet wird. An dem Punkt, an dem sich das Wachstum mit dem E-Streifen schneidet, gibt der entsprechende Wert auf der Skala den MIC-Wert des Antibiotikums an.

Oft werden Antibiotika in Kombination verwendet, um das Auftreten von antibiotikaresistenten Bakterienstämmen zu verhindern. Dies führt oft zu einem synergistischen, nicht additiven Effekt. Synergistisch bedeutet, dass die kombinierte Wirkung der beiden Antibiotika größer ist als die Summe ihrer individuellen Aktivitäten. Der Effekt wird jedoch nur dann als signifikant angesehen, wenn der MIC-Wert der Antibiotika-Kombination um mindestens das Zweifache abnimmt. Dieses Kriterium wird durch Berechnung der fraktionalen hemmenden Konzentration (FIC-Index) bewertet. Durch die Zusammenfassung des Verhältnisses des MIC jedes Antibiotikums in Kombination mit dem MIC jedes Antibiotikums einzeln gibt ein FIC-Index unter 0,5 Synergien an.

Antibiotika-Synergien können mit zwei E-Test-basierten Methoden gemessen werden: einem Nicht-Kreuztest oder einem Kreuztest. In einem Nicht-Kreuztest werden zunächst die E-Streifen für zwei verschiedene Antibiotika mit vorgegebenen MIC-Werten auf zwei separate Platten aufgebracht. Nachdem die Antibiotika in das Medium gestreut wurden, werden die ursprünglichen E-Streifen entfernt und die E-Streifen für die alternativen Antibiotika so platziert, dass ihre MIC-Waagen genau über den MIC-Skalen der vorherigen Streifen liegen. In einem Kreuztest, der eine schnellere Version des Nicht-Kreuztests ist, werden die E-Streifen der beiden Antibiotika in einer Querformation zusammengelegt, so dass die Skalen ihrer MIC-Markierungen einen 90-Grad-Winkel am Schnittpunkt bilden. Nach der Inkubation in beiden Techniken wird der MIC-Wert jedes Antibiotikums in Kombination mit dem anderen Antibiotikum an der Stelle gelesen, an der sich die Wachstumshemmungszone mit dem Rand des E-Streifens schneidet. Anschließend wird der FIC-Index berechnet.

Dieses Video zeigt, wie der MIC-Wert eines bestimmten Antibiotikums für ein bestimmtes Bakterium mithilfe eines E-Tests und eines Mikrobrühe-Verdünnungstests ermittelt wird. Sie lernen auch, wie man Synergien zwischen zwei Antibiotika mit einem Kreuztest und einem Nicht-Kreuztest bestimmt.

Zunächst sollten Sie alle geeigneten persönlichen Schutzausrüstungen anziehen, einschließlich Laborhandschuhen und einem Labormantel. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Als nächstes sammeln Sie 15 Milliliter sterile Mueller-Hinton-Brühe mit 50% lysiertem Pferdeblut und 20 Milligramm pro Milliliter Beta-Nicotinamid. Und fünf bis acht Mueller-Hinton Agarplatten. Um nun eine McFarland Trübungsstandardnummer 0,5 vorzubereiten, messen Sie 9,95 Milliliter 1% Schwefelsäurelösung aus. Dann 50 Mikroliter 1% Bariumchloridlösung in die Schwefelsäurelösung geben. Wirbel die Lösung gut, um eine trüben Suspension zu erhalten. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und legen Sie es beiseite. Als nächstes geben Sie einen Milliliter Salinelösung in ein 15-Milliliter-Rohr.

Verwenden Sie eine sterile Schleife, um eine Probe des bakteriellen Wachstums von Ihrer bakteriellen Testplatte zu kratzen, hier, Streptococcus Gruppe G. Dann legen Sie die bakterielle Schleife in die Herz-Kreislauf-Lösung, rühren Sie sanft, und dann wirbeln Sie das Rohr gut. Stellen Sie nun die bakterielle Suspension und die McFarland Trübungsstandards nebeneinander und vergleichen Sie sie auf Trübungsäquivalenz. Fügen Sie entweder zusätzliche Saline- oder Bakterienkolonien hinzu, bis die Trübung der bakteriellen Suspension mit der des Standards übereinstimmt. Sobald die gewünschte Trübung erreicht ist, tauchen Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator in die bakterielle Suspension. Um die MH-A-Platte zu impfen, wischen Sie die gesamte Oberfläche der Platte sanft mit einer Zickzackbewegung ab. Als nächstes beschriften Sie die untere Seite der Platten mit dem Namen der Bakterien und dem Datum.

Nehmen Sie zunächst einen Penicillin G E-Teststreifen heraus und halten Ihn mit Zangen an der Kante. Ziehen Sie den Streifen vorsichtig in die Mitte der frisch getupften MH-A-Platte und ersetzen Sie den Deckel. In diesem Beispiel wird auch ein zweites Antibiotikum, Gentamicin, getestet. So wird der Streifenplatzierungsprozess mit der zweiten Platte und einem Gentamicin E-Teststreifen wiederholt. Um die Ergebnisse des E-Tests zu bestimmen, sammeln Sie die erste Platte, die den Penicillin G E-Teststreifen enthält. Bestimmen Sie nun den Punkt, an dem sich die Hemmungszone mit dem Antibiotikastreifen schneidet. Lesen Sie den entsprechenden numerischen Wert auf der Skala. Dieser Wert stellt den MIC-Wert von Penicillin G dar. Bestimmen Sie den MIC-Wert für Gentamicin auf die gleiche Weise.

Zunächst impfen Sie eine MH-A-Platte mit Streptococcus-Gruppe G-Stammbakterien. Beschriften Sie den Boden der Platte mit dem Namen der Bakterien, den zu verwendenden Antibiotika und dem Datum. Legen Sie nun einen E-Teststreifen für das Antibiotikum von Interesse in der Mitte der Platte. Halten Sie dann den zweiten Teststreifen in einem 90-Grad-Winkel zum ersten Streifen und suchen Sie seine MIC-Markierung. Legen Sie den zweiten E-Streifen vorsichtig über den ersten Punkt, an dem sich die beiden MIC-Werte schneiden. Sobald die Streifen platziert sind, bewegen Sie sie nicht. Als nächstes bebrüten die Platten bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Stunden.

Nach der Impfung von zwei MH-A-Platten mit Streptococcus-Stammbakterien der Gruppe G legen Sie einen E-Teststreifen für ein Antibiotikum auf die Oberfläche einer Platte. Legen Sie dann einen E-Teststreifen für das andere Antibiotikum auf die zweite Platte, wie gezeigt. Markieren Sie mit einer Kunststoff-Impfschleife den MIC-Wert jedes Antibiotikums auf der Oberfläche seiner jeweiligen Platte. Als nächstes bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Danach verwenden Sie Zangen, um die E-Streifen zu entfernen. Als nächstes sammeln Sie eine der Platten und einen E-Teststreifen für das andere Antibiotikum. Halten Sie den E-Teststreifen über den Aufdruck links durch den ersten Streifen und suchen Sie den Punkt, an dem der MIC-Wert auf dem E-Streifen an der markierten Linie ausgerichtet ist. Platzieren Sie den Streifen vorsichtig an diesem Schnittpunkt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Platte und bebrüten beide Platten bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Stunden.

Zuerst erhalten Sie eine bakterielle Suspension mit einer etablierten bakteriellen Konzentration und verdünnen Sie die Kultur in MHF-Brühe, um eine OD600 von 0,003 zu erreichen. Als nächstes, wiegen 16 Milligramm Penicillin G und 128 Milligramm Gentamicin. Jedes gewogene trockene Antibiotikum in 215 Milliliter konische Schläuche übertragen. Fügen Sie 10 Milliliter destilliertes Wasser in jede der konischen Rohre und mischen Sie gut durch Wirbeln. Beschriften Sie die Tuben mit dem Namen und der Konzentration des Antibiotikums.

Durch die Durchführung des Assays in Dreifacharbeit 400 Mikroliter der arbeitenden bakteriellen Lösung in die ersten Brunnen von drei Reihen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geben. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter der arbeitenden bakteriellen Lösung in MHF-Brühe zu den Brunnen der drei Reihen hinzu. Um nun eine zweifache serielle Antibiotikaverdünnung zu erzeugen, fügen Sie zunächst vier Mikroliter Antibiotika-Lager in den ersten Brunnen ein und erzeugen eine 100-fache Verdünnung. Sequenziell übertragen Sie 200 Mikroliter Bakterien-Antibiotikum-Lösung auf jeden Brunnen, vom ersten Brunnen bis zum letzten Brunnen in jeder Reihe, sorgen sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie nach jedem Transfer zwei- bis dreimal pipetieren. Entsorgen Sie die letzten 200 Mikroliter bakterienantibiotischer Lösung.

Um die Ergebnisse des Brühe-Mikroverdünnungstests für Penicillin G zu bestimmen, lokalisieren Sie zunächst die Brunnen, die kein sichtbares bakterienwachstum aufweisen, was durch einen Mangel an Trübung angezeigt wird. Identifizieren Sie aus diesen Brunnen den Brunnen mit der niedrigsten Antibiotikakonzentration. Dies stellt den MIC-Wert von Penicillin G für die getesteten Bakterien dar. Der MIC-Wert von Gentamicin kann mit dem gleichen Test und der gleichen Technik bestimmt werden.

Um die Ergebnisse des Nicht-Kreuztests zu bestimmen, sammeln Sie die erste Platte, die einen Penicillin G E Streifen enthält. Bestimmen Sie dann den Punkt, an dem sich die Wachstumshemmungszone mit dem Antibiotikastreifen schneidet. Der entsprechende Wert auf der Skala stellt den MIC-Wert für Penicillin G in Kombination mit Gentamicin dar. In diesem Beispiel beträgt der MIC-Wert in Kombination 0,064 Mikrogramm pro Milliliter.

Sammeln Sie nun die zweite Platte, die den Gentamicin-E-Streifen enthält, und bestimmen Sie den MIC-Wert in Kombination, wie zuvor gezeigt. Um die Wirkung der Kombination zu bewerten, berechnen Sie zuerst die fraktionelle hemmende Konzentration oder FIC für Penicillin G, indem Sie das MIC in Kombination durch das MIC des Antibiotikums allein dividieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Gentamicin. Berechnen Sie dann den FIC-Index anhand der hier gezeigten Gleichung. Eine zweifache Reduktion des MIC-Wertes in Kombination ergibt einen FIC-Indexwert, der kleiner oder gleich 0,5 ist und Synergien zwischen Penicillin G und Gentamicin zeigt. In diesem Fall ist der berechnete FIC-Wert 1,18, was größer als 0,5 ist. So zeigen die Ergebnisse keine Synergie zwischen Penicillin G und Gentamicin gegen die Streptococcus-Gruppe G-Sorte.

Um die Ergebnisse des Kreuztests zu bestimmen, bestimmen Sie zunächst den Punkt, an dem sich die Wachstumshemmungszonen mit ihren jeweiligen E-Streifen schneiden. Lesen Sie den numerischen Wert auf jedem E-Teststreifen, der diesem Schnittpunkt entspricht. Diese Werte stellen den MIC-Wert in Kombination mit Penicillin G und Gentamicin dar. Um den Effekt der Kombination zu bewerten, berechnen Sie den FIC-Index anhand der hier gezeigten Gleichung. In diesem Beispiel ist der berechnete FIC-Wert 1,18, der größer als 0,5 ist. Dies bedeutet, dass Penicillin G und Gentamicin nicht synergistisch gegen die Streptococcus Gruppe G-Stamm handeln.

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