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Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos
 

Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos: Pruebas de epsilometro para determinar los valores de MIC de dos antibióticos y evaluar la sinergia de antibióticos

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La susceptibilidad a los antibióticos se define como la sensibilidad de una bacteria a los antibióticos y se puede medir mediante una prueba de dilución de caldo o una prueba de epsilometro, también llamada prueba E.

En el método de dilución de caldo, se añade un número estandarizado de bacterias a un medio de crecimiento que contiene diluciones de antibióticos en serie. Si es susceptible, las bacterias no pueden crecer a las concentraciones más altas de antibióticos, sino que continúan multiplicándose a las concentraciones más bajas de antibióticos, haciendo que los medios se vuelvan turbiontes. La concentración más baja de antibióticos en la que las bacterias ya no pueden sobrevivir o multiplicarse se conoce como la concentración inhibitoria mínima, o MIC, valor del antibiótico para las bacterias dadas.

En una prueba E, una tira de plástico impregnada con un degradado predefinido de antibiótico se aplica sobre un césped recién extendido de bacterias en un agar Mueller-Hinton, o MH-A, placa Petri. El antibiótico se difunde en el medio de agar, donde es tomado por las bacterias. Si es susceptible, las bacterias no pueden multiplicarse y morirán, formando una zona clara alrededor de la tira E, que se conoce como la zona de inhibición del crecimiento. En el punto donde el crecimiento se cruza con la tira E, el valor correspondiente en la escala da el valor MIC del antibiótico.

A menudo se utilizan antibióticos en combinación para prevenir la aparición de cepas de bacterias resistentes a los antibióticos. Esto a menudo resulta en un efecto sinérgico, en lugar de aditivo. Sinérgico significa que el efecto combinado de los dos antibióticos es mayor que la suma de sus actividades individuales. Sin embargo, el efecto se considera significativo sólo cuando el valor MIC de la combinación de antibióticos disminuye al menos dos veces. Este criterio se evalúa calculando el índice de concentración inhibitoria fraccionaria, o IC. Al sumar la relación del MIC de cada antibiótico en combinación con el MIC de cada antibiótico individualmente, un índice de FIC inferior a 0,5 indica sinergia.

La sinergia de antibióticos se puede medir utilizando dos métodos basados en pruebas E: una prueba no cruzada o una prueba cruzada. En una prueba no cruzada, en primer lugar, las tiras E para dos antibióticos diferentes con valores de MIC predeterminados se aplican a dos placas separadas. Después de que los antibióticos se hayan difuminado en el medio, se extraen las tiras E originales y se colocan las tiras E para los antibióticos alternativos de tal manera que sus escamas MIC se encuentran exactamente sobre las escamas MIC de las tiras anteriores. En una prueba cruzada, que es una versión más rápida de la prueba no cruzada, las tiras E de los dos antibióticos se colocan juntas en una formación cruzada, de modo que las escalas de sus marcas MIC forman un ángulo de 90 grados en la intersección. Después de la incubación en ambas técnicas, el valor MIC de cada antibiótico en combinación con el otro antibiótico se lee en el punto donde la zona de inhibición del crecimiento se cruza con el borde de la tira E. A continuación, se calcula el índice FIC.

Este video demostrará cómo determinar el valor MIC de un antibiótico dado para una bacteria dada usando una prueba E y una prueba de dilución de micro caldo. También aprenderá a determinar la sinergia entre dos antibióticos mediante una prueba cruzada y una prueba no cruzada.

Para empezar, ponte cualquier equipo de protección personal adecuado, incluidos los guantes de laboratorio y una capa de laboratorio. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol. A continuación, recoger 15 mililitros de caldo estéril Mueller-Hinton con 50% de sangre de caballo lysed y 20 miligramos por mililitro beta-nicotinamida. Y de cinco a ocho placas de agar Mueller-Hinton. Ahora, para preparar un número estándar de turbidez de McFarland 0.5, mida 9,95 mililitros de solución de ácido sulfúrico al 1%. A continuación, añadir 50 microlitros de 1% solución de cloruro de bario a la solución de ácido sulfúrico. Vortex la solución bien para obtener una suspensión turbia. Cubra el tubo con papel de aluminio y deje a un lado. A continuación, dispensar un mililitro de solución salina en un tubo de 15 mililitros.

Utilice un lazo estéril para raspar una muestra del crecimiento bacteriano de su placa de prueba bacteriana, aquí, Streptococcus grupo G. A continuación, coloque el lazo cargado de bacterias en la solución salina, revuelva suavemente y luego vórtice bien el tubo. Ahora, coloque la suspensión bacteriana y los estándares de turbidez de McFarland uno al lado del otro y compárelos para la equivalencia de turbidez. Agregue colonias salinas o bacterianas adicionales hasta que la turbidez de la suspensión bacteriana coincida con la del estándar. Una vez obtenida la turbidez deseada, sumerja un aplicador estéril de punta de algodón en la suspensión bacteriana. Para inocular la placa MH-A, frote suavemente toda la superficie de la placa con un movimiento en zigzag. A continuación, etiquete los lados inferiores de las placas con el nombre de las bacterias y la fecha.

Para empezar, sacar una tira de prueba en E de penicilina G, sosteniéndola por el borde con fórceps. Coloque suavemente la tira en el centro de la placa MH-A recién histélica y reemplace la tapa. En este ejemplo, también se prueba un segundo antibiótico, la gentamicina. Por lo tanto, el proceso de colocación de tiras se repite con la segunda placa y una tira de prueba en E de gentamicina. Para determinar los resultados de la prueba E, recoja la primera placa que contiene la tira de prueba E de penicilina G. Ahora, determine el punto donde la zona de inhibición se interseca con la tira antibiótica. Lea el valor numérico correspondiente en la escala. Este valor representa el valor MIC de la penicilina G. Determinar el valor MIC para la gentamicina de la misma manera.

Para empezar, inocular una placa MH-A con bacterias de la cepa G del grupo Streptococcus. Etiquete la parte inferior de la placa con el nombre de las bacterias, los antibióticos que se utilizarán y la fecha. Ahora, coloque una tira de prueba E para el antibiótico de interés en el centro de la placa. A continuación, sostenga la segunda tira de prueba en un ángulo de 90 grados con respecto a la primera tira y localice su marca MIC. Coloque suavemente la segunda tira E sobre la primera en el punto donde se intersecan los dos valores MIC. Una vez colocadas las tiras, no las mueva. A continuación, incubar las placas a 37 grados centígrados durante 18 a 20 horas.

Después de inocular dos placas MH-A, con bacterias de cepa Destreptococcus grupo G, coloque una tira de prueba E para un antibiótico en la superficie de una placa. A continuación, coloque una tira de prueba E para el otro antibiótico en el segundo plato como se ha demostrado. Usando un lazo de inoculación de plástico, marque el valor MIC de cada antibiótico en la superficie de su placa respectiva. A continuación, cubrir las placas e incubarlas a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, utilice fórceps para quitar las tiras E. A continuación, recoja uno de los platos y una tira de prueba E para el otro antibiótico. Sostenga la tira de prueba E sobre la huella dejada por la primera tira y localice el punto donde el valor MIC de la tira E se alinea con la línea marcada. Coloque suavemente la tira en este punto de intersección. Repita este proceso para la segunda placa e incubar ambas placas a 37 grados centígrados durante 18 a 20 horas.

En primer lugar, obtener una suspensión bacteriana con una concentración bacteriana establecida y diluir el cultivo en caldo MHF para lograr un OD600 de 0.003. A continuación, pesar 16 miligramos de penicilina G y 128 miligramos de gentamicina. Transfiera cada antibiótico seco pesado en tubos cónicos de 215 mililitros. Añadir 10 mililitros de agua destilada a cada uno de los tubos cónicos y mezclar bien por vórtice. Etiquete los tubos con el nombre y la concentración de los antibióticos.

Realizando el ensayo en triplicado, añadir 400 microlitros de la solución bacteriana de trabajo en los primeros pocillos de tres filas de una placa de microtíter de 96 pocillos. A continuación, añadir 200 microlitros de la solución bacteriana de trabajo en caldo MHF a los pozos de las tres filas. Ahora, para generar una dilución de antibióticos en serie doble, primero agregue cuatro microlitros de stock de antibióticos al primer pozo, generando una dilución de 100 veces. Secuencialmente, transferir 200 microlitros de solución bacteriana-antibiótico a cada pocal, comenzando desde el primer pozo hasta el segundo para durar bien en cada fila, asegurar una mezcla adecuada mediante la pipeteo de dos a tres veces después de cada transferencia. Deseche los 200 microlitros finales de solución antibiótica de bacterias.

Para determinar los resultados de la prueba de micro dilución de caldo para la penicilina G, primero localizar los pozos que no presentan crecimiento bacteriano visible, indicado por la falta de turbidez. A partir de estos pozos, identificar el pozo con la concentración más baja de antibióticos. Esto representa el valor MIC de la penicilina G para las bacterias analizadas. El valor MIC de la gentamicina se puede determinar utilizando el mismo ensayo y técnica.

Para determinar los resultados de la prueba no cruzada, recoja la primera placa, que contiene una tira de penicilina G E. A continuación, determine el punto donde la zona de inhibición del crecimiento se interseca con la tira antibiótica. El valor correspondiente en la escala representa el valor MIC para la penicilina G en combinación con la gentamicina. En este ejemplo, el valor MIC en combinación es 0.064 microgramos por mililitro.

Ahora, recoja la segunda placa, que contiene la tira de gentamicina E, y determine el valor MIC en combinación como se ha demostrado anteriormente. Para evaluar el efecto de la combinación, primero calcule la concentración inhibitoria fraccionada o la FIC para la penicilina G dividiendo el MIC en combinación por el MIC del antibiótico solo. Repita este proceso para la gentamicina. A continuación, calcule el índice FIC utilizando la ecuación que se muestra aquí. Una reducción doble del valor MIC en combinación produce un valor de índice FIC que es menor o igual que 0,5 y demuestra sinergia entre la penicilina G y la gentamicina. En este caso, el valor FIC calculado es 1,18 que es mayor que 0,5. Por lo tanto, los resultados no demuestran sinergia entre la penicilina G y la gentamicina frente a la cepa G del grupo Streptococcus.

Para determinar los resultados de la prueba cruzada, primero determine el punto donde las zonas de inhibición del crecimiento se intersecan con sus respectivas tiras E. Lea el valor numérico en cada tira de prueba E que corresponda a este punto de intersección. Estos valores representan el valor MIC en combinación para penicilina G y gentamicina. A continuación, para evaluar el efecto de la combinación, calcule el índice FIC utilizando la ecuación que se muestra aquí. En este ejemplo, el valor FIC calculado es 1.18, que es mayor que 0.5. Esto significa que la penicilina G y la gentamicina no actúan sinérgicamente contra la cepa G del grupo Streptococcus.

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