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抗生素敏感性测试:Epsilo计测试,以确定两种抗生素的MIC值,并评估抗生素协同效应
 

抗生素敏感性测试:Epsilo计测试,以确定两种抗生素的MIC值,并评估抗生素协同效应

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抗生素易感性被定义为细菌对抗生素的敏感性,可以使用肉汤稀释测试或Epsilo计测试(也称为电子测试)进行测量。

在肉汤稀释法中,在含有连续抗生素稀释的生长介质中加入标准化数量的细菌。如果易感,细菌不能以较高的抗生素浓度生长,但继续以较低的抗生素浓度繁殖,导致介质变浑浊。细菌无法生存或繁殖的最低抗生素浓度称为特定细菌的抗生素最低抑制浓度(即 MIC) 值。

在E测试中,在穆勒-欣顿琼琼琼琼鱼或MH-A,Petri板上,在刚刚传播的细菌草坪上涂上浸渍抗生素预定义梯度的塑料条。抗生素扩散到琼脂培养物中,在那里被细菌所接受。如果易感,细菌不能繁殖,就会死亡,在电子条周围形成一个清晰的区域,称为生长抑制区。在生长与电子条相交的点,刻度上的相应值给出抗生素的MIC值。

通常使用抗生素来防止细菌的抗生素耐药菌株的出现。这通常会导致协同效应,而不是累加效应。协同效应意味着两种抗生素的综合效应大于其个体活动的总和。然而,只有当抗生素组合的MIC值至少降低两倍时,这种效果才被认为是显著的。通过计算分数抑制浓度(或 FIC)指数来评估此标准。通过将每种抗生素的MIC与每种抗生素的MIC分别相和,FIC指数小于0.5表示协同效应。

抗生素协同作用可以使用两种基于电子测试的方法进行测量:非交叉测试或交叉测试。在非交叉测试中,首先,两种具有预定 MIC 值的不同抗生素的 E 条应用于两个单独的板。抗生素扩散到介质后,将去除原来的电子条,并放置备用抗生素的E条,使其MIC刻度完全位于先前带的MIC刻度上。在交叉测试中,这是一个更快的非交叉测试版本,两种抗生素的E条被放置在一个交叉形式,这样他们的MIC标记的尺度在交叉处形成90度角。在两种技术中孵育后,在生长抑制区与电子条的边缘相交时,将读取每种抗生素与其他抗生素结合的MIC值。然后,计算 FIC 索引。

本视频将演示如何使用电子测试和微汤稀释测试确定给定细菌的给定抗生素的 MIC 值。您还将学习如何使用交叉测试和非交叉测试来确定两种抗生素之间的协同作用。

首先,穿上任何适当的个人防护装备,包括实验室手套和实验室外套。接下来,使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。接下来,收集15毫升无菌的穆勒-欣顿肉汤,含有50%的乳化马血和每毫升20毫克β-烟酰胺。和五到八个穆勒-欣顿琼脂板。现在,准备麦克法兰浊度标准号0.5,测量出9.95毫升的1%硫酸溶液。然后,在硫酸溶液中加入50微升1%氯化铵溶液。涡旋溶液良好,获得浑浊悬浮液。用铝箔盖住管子,放在一边。接下来,将一毫升盐水溶液放入15毫升的管子中。

使用无菌循环从细菌测试板中刮取细菌生长的样本,这里,链球菌组 G。然后,将充满细菌的循环放入盐水溶液中,轻轻搅拌,然后涡旋管好。现在,将细菌悬浮液和麦克法兰浊度标准并排放置,并比较其浊度等价性。加入额外的盐水或细菌菌落,直到细菌悬浮液的浊度符合标准。一旦获得所需的浊度,将无菌棉尖施用器浸入细菌悬浮液中。要给 MH-A 板接种,请用锯齿形运动轻轻拭动整个板表面。接下来,在板的底部贴上细菌的名称和日期。

首先,拿出一个青霉素G E测试条,用钳子在边缘握住它。将条带轻轻放入刚擦拭的 MH-A 板的中心,然后更换盖子。在此示例中,还测试了第二种抗生素 gentamicin。因此,带子放置过程重复与第二板和gentamicin E测试条。要确定电子测试的结果,请收集包含青霉素 G E 测试条的第一个板。现在,确定抑制区与抗生素条相交的点。读取刻度上的相应数值。此值表示青霉素 G 的 MIC 值。

首先,用链球菌组G菌株接种MH-A板。在盘子底部贴上细菌名称、使用抗生素和日期的标签。现在,在盘子的中心放置一个电子测试条,用于感兴趣的抗生素。然后,以 90 度角将第二个测试条与第一条条保持至第一条,并找到其 MIC 标记。在两个 MIC 值相交的点上,轻轻地将第二个电子条条放在第一个电子条带上。放置条带后,不要移动它们。接下来,在37摄氏度下孵育板18至20小时。

接种两个MH-A板后,用链球菌组G菌株,在一个板的表面放置一个抗生素的E测试条。然后,如所示,在第二个板上放置另一种抗生素的E测试条。使用塑料接种回路,在各自板的表面标记每种抗生素的MIC值。接下来,覆盖盘子,在室温下孵育一小时。在此之后,使用钳子卸下 E 条。接下来,收集一个板和一个电子测试条,用于另一种抗生素。将电子测试条放在第一条条留下的印记上,并找到 E 条上的 MIC 值与标记的线对齐的点。轻轻地将条带放在这个相交点。对第二个板重复此过程,并在 37 摄氏度下孵育两个板 18 到 20 小时。

首先,获得具有既定细菌浓度的细菌悬浮液,并稀释MHF汤中的培养物,以达到0.003的OD600。接下来,称量16毫克青霉素G和128毫克的绅士青霉素。将每个称量的干抗生素转移到215毫升锥形管中。在每个锥形管中加入10毫升蒸馏水,通过涡旋混合均匀。用抗生素名称和浓度标记管子。

在三联体中执行测定,将400微升的工作细菌溶液加入96孔微蒂剂板三排的第一口井中。接下来,在MHF汤中加入200微升的工作细菌溶液到三排的井中。现在,要产生双倍连续抗生素稀释,首先在第一口井中加入四微升抗生素,产生100倍稀释。依次,将200微升的细菌抗生素溶液输送到每口井,从第一口从第一口从第二口到每行最后一口,每次转液两到三次,确保适当混合。丢弃最后200微升的细菌抗生素溶液。

要确定青霉素G的溴微稀释试验的结果,首先找到没有明显细菌生长的井,表明缺乏浊度。从这些井中,确定抗生素浓度最低的油井。这表示被测细菌的青霉素G的MIC值。根霉质的MIC值可以用相同的测定法和技术来确定。

要确定非交叉测试的结果,请收集包含青霉素 G E 条的第一个板。然后,确定生长抑制区与抗生素条相交的点。刻度上的相应值表示青霉素 G 的 MIC 值与根霉素结合使用。在此示例中,MIC 值组合为每毫升 0.064 微克。

现在,收集包含绅士的E条的第二个板,并确定MIC值组合,如前面演示。要评估组合的效果,首先计算青霉素G的分馏抑制浓度或FIC,将MIC结合为抗生素的MIC。重复此过程的绅士。然后,使用此处所示的方程计算 FIC 指数。组合的 MIC 值减少两倍,可产生小于或等于 0.5 的 FIC 指数值,并表现出青霉素 G 和 gentamicin 之间的协同作用。在这种情况下,计算的 FIC 值为 1.18,大于 0.5。因此,结果不能证明青霉素G和根霉素对链球菌组G菌株的协同作用。

要确定交叉测试的结果,首先确定生长抑制区与其各自的 E 条相交的点。读取对应于此交点的每个电子测试条上的数值。这些值表示青霉素 G 和根霉素的组合的 MIC 值。接下来,要评估组合的效果,请使用此处所示的方程计算 FIC 指数。在此示例中,计算的 FIC 值为 1.18,大于 0.5。这意味着青霉素G和根霉素对链球菌组G菌株不协同作用。

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