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Tests de susceptibilité aux antibiotiques
 

Tests de susceptibilité aux antibiotiques : Tests d'epsilomètre pour déterminer les valeurs MIC de deux antibiotiques et évaluer la synergie antibiotique

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La susceptibilité aux antibiotiques est définie comme la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques et peut être mesurée à l'aide d'un test de dilution du bouillon ou d'un test d'epsilomètre, également appelé E-test.

Dans la méthode de dilution du bouillon, un nombre normalisé de bactéries sont ajoutés à un milieu de croissance contenant des dilutions antibiotiques en série. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se développer à des concentrations plus élevées d'antibiotiques, mais continuent de se multiplier aux concentrations d'antibiotiques les plus faibles, ce qui entraîne la turbidie des médias. La plus faible concentration d'antibiotiques à laquelle les bactéries ne peuvent plus survivre ou se multiplier est appelée la concentration inhibitrice minimale, ou MIC, valeur de l'antibiotique pour les bactéries données.

Dans un E-test, une bande de plastique imprégnée d'un gradient prédéfini d'antibiotique est appliquée sur une pelouse fraîchement répandue de bactéries sur une agar Mueller-Hinton, ou MH-A, plaque Petri. L'antibiotique se diffuse dans le support d'agar, où il est pris par les bactéries. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se multiplier et mourront, formant une zone claire autour de la bande Électronique, qui est appelée zone d'inhibition de la croissance. Au point où la croissance se croise avec la bande Électronique, la valeur correspondante sur l'échelle donne la valeur MIC de l'antibiotique.

Souvent, les antibiotiques sont utilisés en combinaison pour empêcher l'émergence de souches résistantes aux antibiotiques de bactéries. Il en résulte souvent un effet synergique plutôt qu'additif. Synergique signifie que l'effet combiné des deux antibiotiques est plus grand que la somme de leurs activités individuelles. Cependant, l'effet n'est considéré comme significatif que lorsque la valeur MIC de la combinaison d'antibiotiques diminue d'au moins deux fois. Ce critère est évalué en calculant l'indice de concentration inhibitrice fractionnaire, ou FIC. En résumant le rapport du MIC de chaque antibiotique en combinaison avec le MIC de chaque antibiotique individuellement, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie.

La synergie antibiotique peut être mesurée à l'aide de deux méthodes basées sur l'e-test : un test non croisé ou un test croisé. Dans un test non croisé, premièrement, les e-bandes pour deux antibiotiques différents avec des valeurs MIC prédéterminées sont appliquées à deux plaques distinctes. Une fois que les antibiotiques se sont diffusés dans le milieu, les e-bandes d'origine sont enlevées et les E-bandes pour les antibiotiques alternatifs sont placées de telle sorte que leurs écailles de MIC se trouvent exactement sur les échelles de MIC des bandes précédentes. Dans un test croisé, qui est une version plus rapide de l'essai non croisé, les E-bandes des deux antibiotiques sont placées ensemble dans une formation croisée, de sorte que les écailles de leurs marques MIC forment un angle de 90 degrés à l'intersection. Après l'incubation dans les deux techniques, la valeur MIC de chaque antibiotique en combinaison avec l'autre antibiotique est lue au point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec le bord de la bande Électronique. Ensuite, l'indice FIC est calculé.

Cette vidéo démontrera comment déterminer la valeur MIC d'un antibiotique donné pour une bactérie donnée à l'aide d'un test électronique et d'un test de dilution micro bouillon. Vous apprendrez également comment déterminer la synergie entre deux antibiotiques à l'aide d'un test croisé et d'un test non croisé.

Pour commencer, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Ensuite, recueillir 15 millilitres de bouillon stérile Mueller-Hinton avec 50% de sang de cheval lysé et 20 milligrammes par millilitre de bêta-nicotinamide. Et cinq à huit plaques d'agar Mueller-Hinton. Maintenant, pour préparer un numéro standard de turbidité McFarland 0.5, mesurez 9.95 millilitres de solution d'acide sulfurique de 1%. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de 1% de chlorure de baryum solution à la solution d'acide sulfurique. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide. Couvrir le tube de papier d'aluminium et le réserver. Ensuite, dispenser un millilitre de solution saline dans un tube de 15 millilitres.

Utilisez une boucle stérile pour gratter un échantillon de la croissance bactérienne de votre plaque d'essai bactérienne, ici, Streptococcus groupe G. Ensuite, placez la boucle chargée de bactéries dans la solution saline, remuer doucement, puis vortex le tube bien. Maintenant, placez la suspension bactérienne et les normes de turbidité McFarland côte à côte et comparez-les pour l'équivalence de turbidité. Ajouter des colonies saline ou bactériennes supplémentaires jusqu'à ce que la turbidité de la suspension bactérienne corresponde à celle de la norme. Une fois que la turbidité désirée est obtenue, trempez un applicateur stérile de pointe de coton dans la suspension bactérienne. Pour inoculer la plaque MH-A, tamponnez doucement toute la surface de la plaque avec un mouvement en zigzag. Ensuite, étiquetez les côtés inférieurs des plaques avec le nom de la bactérie et la date.

Pour commencer, sortir une bande de pénicilline G E-test, en la tenant par le bord avec des forceps. Placez délicatement la bande au centre de la plaque MH-A fraîchement tamponnée et remplacez le couvercle. Dans cet exemple, un deuxième antibiotique, la gentamicine, est également testé. Ainsi, le processus de placement de bande est répété avec la deuxième plaque et une bande de e-test de gentamicine. Pour déterminer les résultats du test E, collectez la première plaque qui contient la bande de test G E de la pénicilline. Maintenant, déterminez le point où la zone d'inhibition se croise avec la bande d'antibiotiques. Lisez la valeur numérique correspondante sur l'échelle. Cette valeur représente la valeur MIC de la pénicilline G. Déterminer la valeur MIC pour la gentamicine de la même manière.

Pour commencer, inoculer une plaque MH-A avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus. Étiquetez le fond de la plaque avec le nom des bactéries, des antibiotiques à utiliser et de la date. Maintenant, placez une bande d'essai e pour l'antibiotique d'intérêt dans le centre de la plaque. Ensuite, maintenez la deuxième bande d'essai à un angle de 90 degrés à la première bande et localisez sa marque MIC. Pose doucement la deuxième e-bande sur la première au point où les deux valeurs MIC se croisent. Une fois les bandes placées, ne les déplacez pas. Ensuite, incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.

Après avoir inoculé deux plaques MH-A, avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus, placez une bande d'essai E pour un antibiotique à la surface d'une plaque. Ensuite, placez une bande d'essai électronique pour l'autre antibiotique sur la deuxième plaque comme démontré. À l'aide d'une boucle d'inoculation en plastique, marquez la valeur MIC de chaque antibiotique à la surface de sa plaque respective. Ensuite, couvrez les assiettes et incuber à température ambiante pendant une heure. Après cela, utilisez des forceps pour enlever les bandes E. Ensuite, collectez l'une des plaques et une bande de test E pour l'autre antibiotique. Maintenez la bande E-test sur l'empreinte laissée par la première bande et localisez le point où la valeur MIC sur la bande E s'aligne avec la ligne marquée. Placez délicatement la bande à ce point d'intersection. Répétez ce processus pour la deuxième plaque et incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.

Tout d'abord, obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie et diluer la culture dans le bouillon MHF pour atteindre un OD600 de 0,003. Ensuite, peser 16 milligrammes de pénicilline G et 128 milligrammes de gentamicine. Transférer chaque antibiotique sec pesé dans des tubes coniques de 215 millilitres. Ajouter 10 millilitres d'eau distillée à chacun des tubes coniques et bien mélanger par vortex. Étiqueter les tubes avec le nom et la concentration des antibiotiques.

En effectuant l'analyse en triplicate, ajouter 400 microlitres de la solution bactérienne de travail dans les premiers puits de trois rangées d'une plaque de microtimètre de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution bactérienne de travail dans le bouillon MHF aux puits des trois rangées. Maintenant, pour générer une dilution antibiotique en série double, d'abord ajouter quatre microlitres de stock d'antibiotiques au premier puits, générant une dilution 100 fois. Séquentiellement, transférer 200 microlitres de bactéries-antibiotique solution à chaque puits, à partir du premier puits à travers le puits deuxième à dernier dans chaque rangée, assurer un bon mélange par pipetting deux à trois fois après chaque transfert. Jetez les 200 derniers microlitres de solution bactéries-antibiotiques.

Pour déterminer les résultats du test de micro dilution du bouillon pour la pénicilline G, localiser d'abord les puits qui ne présentent aucune croissance bactérienne visible, indiquée par un manque de turbidité. À partir de ces puits, identifiez le puits avec la plus faible concentration d'antibiotiques. Cela représente la valeur MIC de la pénicilline G pour les bactéries testées. La valeur MIC de la gentamicine peut être déterminée en utilisant le même résultat et la même technique.

Pour déterminer les résultats de l'essai non croisé, collectez la première plaque, qui contient une bande de pénicilline G E. Ensuite, déterminez le point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec la bande d'antibiotiques. La valeur correspondante sur l'échelle représente la valeur MIC pour la pénicilline G en combinaison avec la gentamicine. Dans cet exemple, la valeur MIC en combinaison est de 0,064 microgramme par millilitre.

Maintenant, recueillir la deuxième plaque, qui contient la bande E gentamicine, et de déterminer la valeur MIC en combinaison comme précédemment démontré. Pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez d'abord la concentration inhibitrice fractionnaire ou FIC pour la pénicilline G en divisant le MIC en combinaison par le MIC de l'antibiotique seul. Répétez ce processus pour la gentamicine. Ensuite, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Une réduction de deux fois de la valeur du MIC en combinaison donne une valeur de l'indice FIC inférieure ou égale à 0,5 et démontre une synergie entre la pénicilline G et la gentamicine. Dans ce cas, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Ainsi, les résultats ne démontrent pas de synergie entre la pénicilline G et la gentamicine avec la souche Streptococcus groupe G.

Pour déterminer les résultats de l'essai croisé, déterminez d'abord le point où les zones d'inhibition de la croissance se croisent avec leurs bandes E respectives. Lisez la valeur numérique sur chaque bande de test Électronique qui correspond à ce point d'intersection. Ces valeurs représentent la valeur MIC en combinaison pour la pénicilline G et la gentamicine. Ensuite, pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Dans cet exemple, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Cela signifie que la pénicilline G et la gentamicine n'agissent pas en synergie contre la souche Streptococcus du groupe G.

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