Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

This content is Free Access.

Spanish
 

Microscopía y tinción: Gram, Cápsula y Tinción de Endospora

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Las bacterias son organismos vivos microscópicos que tienen muchas características distintivas como la forma, la disposición de las células, si producen o no cápsulas, y si forman esporas. Todas estas características se pueden visualizar mediante la tinción y la ayuda en la identificación y clasificación de diferentes especies bacterianas.

Para examinar las dos primeras características de la forma y disposición de la célula, podemos utilizar una técnica simple llamada tinción de Gram. Aquí, el violeta cristalino se aplica a las bacterias, que se han fijado térmicamente en un tobogán. Luego se aplica un decolorante y cualquier bacteria con una capa gruesa de peptidoglycan manchará púrpura, ya que esta capa no es fácilmente penetrada por el decolorante. Estas bacterias se conocen como Gram positivo.

Las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglycan más delgada y desmancharán el decolorante, perdiendo el color púrpura. Sin embargo, mancharán el color rojizo-rosa cuando se añade una mancha de contador de safranina, que se une a una capa de lipopolisacárido en su exterior. Una vez manchadas, las células se pueden observar para la morfología, el tamaño y la disposición, como en cadenas o racimos, lo que ayuda aún más en la clasificación e identificación.

Otra técnica útil en el kit de herramientas del microbiólogo es la mancha de la cápsula, utilizada para visualizar cápsulas externas que rodean algunos tipos de células bacterianas. Debido a la composición no iónica de las cápsulas y la tendencia a repeler las manchas, los métodos de tinción simples no funcionarán. En su lugar, se utiliza una técnica de tinción negativa, que primero mancha el fondo con un colorante ácido, como el rojo Congo, antes de que las células bacterianas se tiñen con violeta cristalino. Esto deja cualquier cápsula presente como un halo transparente alrededor de las células.

La última técnica de tinción principal que se cubre aquí puede ayudar a determinar si las bacterias que se estudian forman esporas. En condiciones adversas, algunas bacterias producen endosporas, estructuras latentes, duras, no reproductivas, cuya función principal es asegurar la supervivencia de las bacterias a través de períodos de estrés ambiental, como temperaturas extremas o deshidratación. Sin embargo, no todas las especies bacterianas producen endosporas, y son difíciles de manchar con técnicas estándar porque son impermeables a muchos colorantes. El método Schaeffer-Fulton utiliza la mancha verde malaquita, que se aplica a las bacterias fijadas a un deslizamiento. A continuación, el portaobjetos se lava con agua antes de ser manchado con safranina. Las células vegetativas aparecerán de color rosáceo-rojo, mientras que cualquier endospora presente aparecerá verde. En este video, aprenderás cómo realizar estas técnicas comunes de tinción bacteriana y luego examinarás las muestras de tinción usando microscopía de luz.

Para comenzar el procedimiento, ate el cabello largo y ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes.

A continuación, limpie un portaobjetos de microscopio fresco con una toallita de laboratorio. A continuación, pipetear 10 microlitros de 1X solución salina tamponada de fosfato en la primera diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta la colonia bacteriana en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ajuste la corredera en la parte superior del banco y deje que se seque completamente al aire.

Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Usando pinzas, pase el deslizamiento a través de la llama del quemador varias veces, con la bacteria hacia arriba, teniendo cuidado de no sostener el portaobjetos en la llama demasiado tiempo, lo que puede distorsionar las células.

Ahora, trabajando sobre el fregadero, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique varias gotas de violeta de cristal de Gram para cubrir completamente el frotis bacteriano y luego, coloque el portaobjetos en el banco para que se pare durante 45 segundos. A continuación, sostenga el portaobjetos en un ángulo y saque suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorro squirt el frotis bacteriano directamente. Ahora, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas y luego, deje que se mantenga reposar durante otros 45 segundos. A continuación, enjuague cuidadosamente el yodo de la diapositiva, como se muestra anteriormente. Mientras sostiene la diapositiva en un ángulo, agregue unas gotas del decolorante de Gram a la diapositiva, lo que le permite correr hacia abajo sobre las bacterias manchadas, sólo hasta que la escorrenza esté clara, durante aproximadamente 5 segundos. Inmediatamente, enjuague con agua como se muestra anteriormente. Esto limitará la decoloración excesiva del frotis. A continuación, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplicar la contramancha de safranina de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas. Después de 45 segundos, enjuague suavemente la safranina del tobogán con agua, como se muestra anteriormente, y luego, seque con toallas de papel.

Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con una lente objetivo de aceite 100X.

Para comenzar este protocolo de tinción, primero coloque el equipo de protección personal correcto y, a continuación, asegúrese de que los portaobjetos de vidrio que se utilizarán estén limpios.

A continuación, prepare las soluciones. Para hacer una solución violeta de cristal al 1%, mezcle 0,25 gramos de polvo violeta de cristal con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. A continuación, prepare una solución roja del 1% en el Congo mezclando 0,25 gramos de polvo rojo del Congo con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. Ahora, pipeta 10 microlitros de la solución roja del Congo en el portaobjetos. Usando una punta de pipeta limpia y estéril, seleccione una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Luego, frota la colonia bacteriana en el tinte para producir una capa delgada y uniforme. Seque completamente al aire el portaobjetos bacteriano durante 5-7 minutos. Una vez que el portaobjetos esté seco, inunda el frotis con suficiente 1% de cristal violeta para cubrir el frotis y déjalo separación durante 1 minuto. Ahora, sostenga el portaobjetos en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua en la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorros de la bacteria directamente. Continúe sosteniendo el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que se seque completamente al aire. Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con un objetivo de aceite 100X.

Para realizar la tinción de endospora, primero, prepare una solución verde malaquita al 0,5% mezclando 0. 125 gramos de polvo verde malaquita con 25 mililitros de agua destilada, y luego vórtice la solución hasta que se disuelva. A continuación, pipeta 10 microlitros de 1X PBS en el centro de la diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta las bacterias en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ahora, pon la corredera en la parte superior del banco y deja que se seque completamente al aire. Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Pase el deslizamiento a través de la llama del quemador azul varias veces, con el lado de la bacteria hacia arriba. Luego, una vez que la diapositiva se haya enfriado, coloque un pedazo de papel de lente precortado sobre el frotis de calor fijo. A continuación, encienda una placa eléctrica hasta el entorno más alto y ponga a hervir un vaso de agua.

Saturar el papel de la lente con la solución verde malaquita y, usando pinzas, coloque el tobogán encima del vaso de precipitados de agua hirviendo al vapor durante 5 minutos. Mantenga el papel de la lente húmedo añadiendo más tinte, una gota a la vez, según sea necesario. A continuación, de nuevo con pinzas, recoger la diapositiva del vaso de precipitados y quitar y desechar el papel de la lente. Deje que la diapositiva se enfríe durante 2 minutos. Trabajando sobre el fregadero, sostenga la corredera en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva. Ahora, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique safranina para cubrir completamente la diapositiva. A continuación, deje que se quede de pie durante 1 minuto. A continuación, sostenga la diapositiva en un ángulo y enjuague como se muestra anteriormente. Deje que el portaobjetos se seque al aire en la parte superior del banco. Por último, añadir una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva, y luego, examinar la diapositiva con un microscopio de luz, con un objetivo de aceite 100X.

En el protocolo de tinción de Gram, pueden resultar dos manchas de diferentes colores. La tinción púrpura oscura indica que las bacterias son Gram-positivas, y que han conservado la mancha violeta cristalina. Por el contrario, la tinción de color rosa rojizo es una característica de las bacterias Gram-negativas, que en su lugar será coloreada por la mancha de contador de safranina. Además, diferentes formas y arreglos de bacterias se pueden visualizar después de la tinción de Gram. Por ejemplo, es posible diferenciar Cocci, o bacterias redondas, de Bacillus en forma de varilla, o identificar bacterias que forman hebras, en comparación con las que normalmente se agregan como grumos, o ocurren por separado.

En una imagen de microscopio teñido de cápsula, las células bacterianas normalmente se teñirán púrpura, y el fondo de la diapositiva debe estar teñido oscuramente. Contra este fondo oscuro, las cápsulas de la bacteria, si están presentes, aparecerán como un halo claro alrededor de las células.

Por último, en la tinción de endosporo, las células vegetativas serán teñidas de rojo por la mancha de contracuña de safranina. Si las endosporas están presentes en la muestra, estas conservarán la mancha verde malaquita y aparecerán de color verde azulado.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter