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Microscopia e Coloração

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Microscopia e Coloração: Gram, Cápsula e Endospore Staining

Overview

Fonte: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, e Victor J. DiRita¹
¹ Departamento de Microbiologia e Genética Molecular, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Estados Unidos da América

Bactérias são microrganismos diversos encontrados em quase todos os lugares da Terra. Muitas propriedades ajudam a distingui-los umas das outras, incluindo, mas não se limitando ao tipo de coloração gram, forma e arranjo, produção de cápsula e formação de esporos. Para observar essas propriedades, pode-se usar microscopia leve; no entanto, algumas características bacterianas (por exemplo tamanho, falta de coloração e propriedades refrativas) dificultam a distinção de bactérias apenas com um microscópio leve (1, 2). A coloração de bactérias é necessária ao distinguir tipos bacterianos com microscopia leve. Os dois principais tipos de microscópios leves são simples e compostos. A principal diferença entre eles é o número de lentes usadas para ampliar o objeto. Microscópios simples (por exemplo, uma lupa) têm apenas uma lente para ampliar um objeto, enquanto microscópios compostos têm várias lentes para melhorar a ampliação (Figura 1). Microscópios compostos têm uma lente objetiva perto do objeto que coleta luz para criar uma imagem do objeto. Isso é então ampliado pela ocular (lente ocular) que amplia a imagem. Combinar a lente objetiva e a ocular permite uma ampliação maior do que usar apenas uma única lente. Normalmente, microscópios compostos têm múltiplas lentes objetivas de diferentes poderes para permitir diferentes ampliações (1, 2). Aqui, discutiremos a visualização de bactérias com manchas de Gram, manchas de cápsula e manchas de Endospore.

Figura 1: Um microscópio composto típico. As partes mais importantes do microscópio são rotuladas.

A mancha de Gram, desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram (1), diferencia bactérias baseadas na composição da parede celular (1, 2, 3, 4). Brevemente, uma mancha bacteriana é colocada em um slide de microscópio e, em seguida, fixada a calor para aderir as células ao slide e torná-las mais prontamente aceitando manchas (1). A amostra fixa de calor está manchada com Crystal Violet, tornando as células roxas. O slide é lavado com uma solução de iodo, que fixa o Cristal Violet na parede celular, seguido por um descolorador (um álcool) para lavar qualquer Violeta cristal não fixa. Na etapa final, uma contra-mancha, Safranin, é adicionada às células coloridas vermelhas (Figura 2). As bactérias gram-positivas mancham o roxo devido à espessa camada peptidoglycan que não é facilmente penetrada pelo descolorador; Bactérias gram-negativas, com sua camada peptidoglycan mais fina e maior teor lipídudo, se desarmam com o descolorador e são contra-manchadas de vermelho quando Safranin é adicionado (Figura 3). A coloração gramada é usada para diferenciar células em dois tipos (Gram-positivo e Gram-negativo) e também é útil para distinguir a forma celular (esferas ou cocci, hastes, hastes curvas e espirais) e arranjo (células únicas, pares, cadeias, grupos e clusters) (1, 3).

Figura 2: Esquema do Protocolo de Coloração de Grama. A coluna esquerda mostra como as bactérias Gram-negativas reagem a cada passo do protocolo. A coluna certa mostra como as bactérias Gram-positivas reagem. Além disso, são mostradas duas formas típicas de células bacterianas: os bacilos (ou hastes) e o cocci (ou esferas).

Figura 3: Resultados de coloração de grama. Uma mancha gram de uma mistura de Staphylococcus aureus (Gram-positivo cocci roxo) e Escherichia coli (barras vermelhas Gram-negativas).

Algumas bactérias produzem uma camada externa viscosa extracelular chamada cápsula (3, 5). As cápsulas são estruturas protetoras com várias funções, incluindo, mas não se limitando à adesão a superfícies e outras bactérias, proteção contra profanação e proteção contra fagocitose. As cápsulas são tipicamente compostas de polissacarídeos contendo mais de 95% de água, mas algumas podem conter polialcoólicos e poliaminas (5). Devido à sua composição não iônica e tendência a repelir manchas, métodos simples de coloração não funcionam com cápsula; em vez disso, a coloração da cápsula utiliza uma técnica de coloração negativa que mancha as células e o fundo, deixando a cápsula como um halo claro ao redor das células (1, 3) (Figura 4). A coloração da cápsula envolve a mancha de uma amostra bacteriana em uma mancha ácida em um slide de microscópio. Ao contrário da mancha gram, a mancha bacteriana não é fixada durante uma mancha de cápsula. A fixação de calor pode interromper ou desidratar a cápsula, levando a falsos negativos (5). Além disso, a fixação de calor pode encolher as células resultando em uma clareira ao redor da célula que pode ser confundida como uma cápsula, levando a falsos positivos (3). A mancha ácida colore o fundo do slide; enquanto segue com uma mancha básica, Crystal Violet, colore as próprias células bacterianas, deixando a cápsula sem manchas e aparecendo como um halo claro entre as células e o fundo do slide (Figura 5). Tradicionalmente, a tinta da Índia tem sido usada como mancha ácida porque essas partículas não podem penetrar na cápsula. Portanto, nem a cápsula nem a célula são manchadas pela tinta da Índia; em vez disso, o fundo está manchado. Congo Red, Nigrosin ou Eosin podem ser usados no lugar da tinta da Índia. A coloração da cápsula pode ajudar os médicos a diagnosticar infecções bacterianas ao analisar culturas a partir de amostras de pacientes e orientar o tratamento adequado do paciente. Doenças comuns causadas por bactérias encapsuladas incluem pneumonia, meningite e salmonelose.

Figura 4: Esquema do Protocolo de Coloração da Cápsula. O painel superior mostra a mancha de slides antes de qualquer aplicação de mancha. O painel do meio mostra como o slide e as bactérias cuidam da mancha primária, Congo Red. O painel final mostra como o slide e as bactérias cuidam da contra-mancha, Crystal Violet.

Figura 5: Resultados de coloração da cápsula. Coloração cápsula de Acinetobacter baumannii encapsulada (denotada com setas pretas) e Escherichia coli não encapsulada (denotada com setas brancas). Note que o fundo é escuro e as células A. baumannii estão manchadas de roxo. A cápsula ao redor das células de A. baumannii é evidente como um halo, enquanto E. coli não tem halo.

Em condições adversas (por exemplo, limitação de nutrientes, temperaturas extremas ou desidratação), algumas bactérias produzem endosporos, estruturas metabolicamente inativas resistentes a danos físicos e químicos (1, 2, 8, 9). Os endosporos permitem que a bactéria sobreviva a condições severas, protegendo o material genético das células; uma vez que as condições são favoráveis para o crescimento, os esporos germinam e o crescimento bacteriano continua. Os endosporos são difíceis de colorir com técnicas de coloração padrão porque são impermeáveis a corantes tipicamente usados para coloração (1, 9). A técnica rotineiramente utilizada para manchar endospores é o Método Schaeffer-Fulton (Figura 6),que utiliza a mancha primária Malachite Green, uma mancha solúvel em água que se liga relativamente fracamente ao material celular, e ao calor, para permitir que a mancha rompe através do córtex do esporo (Figura 7). Esses passos colorem as células em crescimento (chamadas células vegetativas no contexto da biologia endospora), bem como endosporos e quaisquer esporos livres (aqueles que não estão mais dentro do antigo envelope celular). As células vegetativas são lavadas com água para remover o Malachite Green; endosporos retêm a mancha devido ao aquecimento do Verde Malachite dentro do esporo. Finalmente, as células vegetativas são contra-manchadas com Safranin para visualizar (Figura 8). A coloração para endosporos ajuda a diferenciar bactérias em ex-esporos e ex-esporos, bem como determina se esporos estão presentes em uma amostra que, se presente, poderia levar à contaminação bacteriana após a germinação.

Figura 6: Esquema do Protocolo de Coloração de Endospore. A coluna esquerda mostra como as bactérias formadoras de esporos reagem a cada passo do protocolo. A coluna direita mostra como as bactérias que formam os não esporos reagem.

Figura 7: Diagrama da Estrutura Endospore. Célula bacteriana contendo um endospore com as várias estruturas de esporos rotuladas.

Figura 8: Resultados de Coloração de Endospore. Uma mancha típica de endosporos de Bacillus subtilis. As células vegetativas (denotadas com as setas brancas) estão manchadas de vermelho, enquanto os endosporos (denotados com as setas pretas) estão manchados de verde.

Procedure

1. Gram Staining

Configuração
1. Use luvas e um jaleco não inflamável, pois os corantes mancharão as mãos e as roupas.
2. Um queimador Bunsen é usado para aquecer a bactéria. Use os cuidados ao trabalhar com chama; amarrar cabelo comprido.
3. Serão utilizados reagentes de manchas Gram disponíveis comercialmente.
4. Limpe slides de microscópio com lenços de laboratório.
Protocolo
1. Pipet 10 μL fosfato tamponado soro fisiológico ou caldo de cultura no slide.
2. Esfregue uma colônia bacteriana no líquido para produzir uma fina camada uniforme.
  Nota: Não use culturas com mais de 24 horas, pois bactérias muito velhas podem ter alterações na parede celular que afetarão os resultados da mancha gram (1, 4).
3. Deslizamento completamente seco.
4. Uma vez secas, as bactérias de fixação de calor passam pela chama (lado da bactéria) 4-5 vezes.
  Nota: Não segure o slide na chama por muito tempo ou você pode distorcer as células bacterianas (1).
5. Trabalhando sobre a pia, segure o nível de slides e aplique o Crystal Violet do Gram para cobrir completamente as bactérias fixas pelo calor, deixe ficar em pé 45 segundos.
6. Enxágüe o excesso de Crystal Violet segurando o slide em um ângulo e esguichando um fluxo de água gentil e indireto no escorregador e deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas. Não esguiche água diretamente nas bactérias.
7. Segurando novamente o nível de slides, aplique a solução de iodo do Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas, deixe ficar em pé 45 segundos.
8. Enxágüe o excesso de Iodo como na etapa 1.2.6 acima.
9. Enquanto segura o slide em um ângulo, adicione algumas gotas de Decolorizer no slide, deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas apenas até que o escoamento esteja limpo; tipicamente, cerca de 5 segundos. Enxágue imediatamente com água como na etapa 1.2.6 acima.
  Nota: Este é um passo crítico no protocolo. Permitir que o Decolorizer escorra por muito tempo ou não o suficiente resultará em falsa mancha de Gram (4).
10. Segurando novamente o nível de slides, aplique o Safranin do Gram para cobrir completamente as bactérias, deixe ficar em pé 45 segundos.
11. Enxágüe o excesso de Safranin como na etapa 1.2.6 acima.
12. Borrida, não esfregue, excesso de água do escorregador usando toalhas de papel.
13. Examine o slide no microscópio usando a imersão em óleo com um objetivo de 100X.
Resultados e Análise de Dados
1. Bactérias gram-positivas mancharão o roxo.
2. Bactérias gram-negativas mancharão o vermelho.
3. A forma (cocci, bacilos, hastes curvas, espirais) de bactérias será visível.
4. O arranjo de células bacterianas (células únicas, células emparelhadas, cadeias de células, aglomerados, agrupamentos) será visível.

2. Mancha de cápsula

Configuração
1. Use luvas e um jaleco como corantes mancham mãos e roupas.
2. Para preparar 1% de solução Crystal Violet, misture 0,25 gramas Crystal Violet com 25 mL de água destilada até dissolver.
3. Para preparar 1% de solução Congo Red, misture 0,25 gramas Congo Vermelho com 25 mL de água destilada até dissolver.
4. Limpe lâminas com lenços de laboratório.
Protocolo
1. Coloque 10 μL Congo Vermelho no slide.
2. Usando uma ponta de pipeta, esfregue uma colônia bacteriana no corante para produzir uma fina camada uniforme.
3. Slide completamente seco com mistura de corante/célula, 5-7 minutos.
  Nota: Não aqueça a correção, pois o aquecimento pode desidratar ou distorcer a cápsula.
4. Inundar a mancha com 1% de Crystal Violet por 1 minuto.
5. Enxágüe o excesso de mancha segurando o slide em um ângulo e esguichando um fluxo de água suave e indireto para o escorregador e deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas. Não esguiche água diretamente nas bactérias.
6. Segure o slide em um ângulo de 45 graus até secar completamente o ar.
7. Examine a mancha no microscópio sob imersão a óleo com um objetivo de 100X.
Resultados e Análise de Dados
1. Células bacterianas mancharão o roxo.
2. O fundo do slide manchará o escuro.
3. Cápsulas serão um halo claro ao redor das células contra um fundo escuro.

3. Coloração de Endospore (método Schaeffer-Fulton)

Configuração
1. Use luvas e jaleco não inflamável para proteger as mãos e as roupas dos corantes e da chama.
2. Um queimador Bunsen é usado para aquecer a bactéria. Use os cuidados ao trabalhar com chama; amarrar cabelo comprido.
3. Para preparar 0,5% solução Malachite Green, misture 0,125 gramas Malachite Green com 25 mL de água destilada até dissolver.
4. Use a solução de reagente Safranin da Gram disponível comercialmente.
5. Limpe lâminas com lenços de laboratório.
Protocolo
1. Pipet 10 μl fosfato tampão salina (PBS) ou caldo de cultura em slide.
2. Usando técnica asséptica, esfregue uma colônia bacteriana no líquido para produzir uma camada fina e uniforme.
  Nota: Os endosporos geralmente não se formam em células jovens, portanto, recomenda-se que a cultura tenha entre 18 e 36 horas (9).
3. Deslizamento completamente seco.
4. Correção de calor passando slide (bactérias lado para cima) através da chama 4-5 vezes.
5. Para ajudar a conter o corante, coloque um pedaço de papel da lente (corte para caber a mancha bacteriana) sobre a mancha fixa de calor.
6. Papel de lente saturada com solução Malachite Green.
7. Coloque deslize em cima de béquer de água fervente em uma placa quente, e deslize a vapor por 5 minutos, mantendo o papel da lente úmido adicionando mais corante uma gota de cada vez, conforme necessário.
  Nota: Evite superaquecer e secar a solução de corante.
8. Remova o slide do béquer, remova e descarte o papel da lente, deixe deslizar para esfriar 2 minutos.
9. Segurando o slide em um ângulo, enxágue completamente esguichando um fluxo de água suave e indireto para o escorregador, permitindo que ele escorra por causa da mancha.
10. Segurando o nível do slide, a mancha de inundação com Safranin, deixe ficar 1 minuto.
11. Enxágüe o excesso de Safranin como na etapa 3.2.9 acima.
12. Deixe secar o ar.
13. Examine o slide no microscópio sob imersão em óleo com um objetivo de 100X.
Resultados e Análise de Dados
1. Esporos mancharão o verde.
2. As células vegetativas mancharão o vermelho.
3. Algumas células vegetativas conterão esporos; as células mancharão o vermelho, enquanto os endosporos mancharão o verde.

As bactérias são organismos vivos microscópicos que têm muitas características distintas, como forma, arranjo de células, se produzem ou não cápsulas, e se formam esporos. Todas essas características podem ser visualizadas pela coloração e auxiliam na identificação e classificação de diferentes espécies bacterianas.

Para examinar as duas primeiras características da forma e arranjo celular, podemos usar uma técnica simples chamada coloração gram. Aqui, a violeta cristalina é aplicada a bactérias, que foram fixadas a calor em um slide. Em seguida, a solução de iodo da Gram é adicionada ao slide, resultando na formação de um complexo insolúvel entre o cristal violeta e a solução de iodo do Gram. Um descolorador é então aplicado e qualquer bactéria com uma espessa camada peptidoglycan manchará o roxo, pois esta camada não é facilmente penetrada pelo descolorador. Essas bactérias são referidas como Gram positivo.

As bactérias gram negativas têm uma camada peptidoglycan mais fina e vão descolorir o descolorador, perdendo a cor roxa. No entanto, eles vão manchar rosa-avermelhado quando uma mancha de contador safranin é adicionada, que se liga a uma camada de lipopólise em seu lado externo. Uma vez manchadas, as células podem ser observadas para morfologia, tamanho e arranjo, como em cadeias ou aglomerados, o que auxilia ainda mais na classificação e identificação.

Outra técnica útil no kit de ferramentas do microbiologista é a mancha de cápsula, usada para visualizar cápsulas externas que circundam alguns tipos de células bacterianas. Devido à composição não iônica das cápsulas e à tendência de repelir manchas, métodos simples de coloração não funcionarão. Em vez disso, é utilizada uma técnica de coloração negativa, que primeiro mancha o fundo com um corante ácido, como o vermelho congolês, antes que as células bacterianas sejam manchadas com violeta cristalina. Isso deixa qualquer cápsula presente como um halo claro ao redor das células.

A técnica final de coloração principal abrangida aqui pode ajudar a determinar se as bactérias que estão sendo estudadas formam esporos. Em condições adversas, algumas bactérias produzem endosporos, estruturas dormentes, resistentes e não reprodutivas, cuja função primária é garantir a sobrevivência de bactérias através de períodos de estresse ambiental, como temperaturas extremas ou desidratação. No entanto, nem todas as espécies bacterianas fazem endosporos, e são difíceis de manchar com técnicas padrão porque são impermeáveis a muitos corantes. O método Schaeffer-Fulton usa mancha verde malachita, que é aplicada às bactérias fixadas em um slide. O slide é então lavado com água antes de ser manchado com safranin. As células vegetativas aparecerão em vermelho-rosa, enquanto os endosporos presentes aparecerão verdes. Neste vídeo, você aprenderá como executar essas técnicas comuns de coloração bacteriana e, em seguida, examinará as amostras de coloração usando microscopia leve.

Para iniciar o procedimento, amarre os cabelos longos e coloque os equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco e luvas.

Em seguida, limpe um novo slide de microscópio com um lenço de laboratório. Em seguida, pipeta 10 microliters de 1X fosfato tamponado soro fisiológico no primeiro slide. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Esfregue a colônia bacteriana no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Coloque o slide na parte superior do banco e deixe-o secar completamente.

Uma vez seco, acenda um bico de Bunsen para aquecer as bactérias. Usando pinças, passe o slide através da chama do queimador várias vezes, com a bactéria de lado para cima, tomando cuidado para não segurar o slide na chama por muito tempo, o que pode distorcer as células.

Agora, trabalhando sobre a pia, segure o nível de slides e aplique várias gotas de violeta cristalina de Gram para cobrir completamente a mancha bacteriana e, em seguida, coloque o slide no banco para ficar por 45 segundos. Em seguida, segure o slide em um ângulo, e esguiche suavemente um fluxo de água na parte superior do escorregador, tomando cuidado para não esguichar a mancha bacteriana diretamente. Agora, segurando o nível de slide novamente, aplique a solução de iodo do Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas e, em seguida, deixe-a ficar por mais 45 segundos. Em seguida, enxágue cuidadosamente o iodo do slide, como mostrado anteriormente. Enquanto segura o slide em um ângulo, adicione algumas gotas do descolorizador de Gram ao slide, permitindo que ele corra sobre as bactérias manchadas, apenas até que o escore esteja limpo, por aproximadamente 5 segundos. Imediatamente, enxágue com água como mostrado anteriormente. Isso limitará o excesso de descoloração da mancha. Em seguida, segurando o nível de slide novamente, aplique a contra-mancha safranin de Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas. Após 45 segundos, enxágue suavemente a safranina do escorregador com água, como mostrado anteriormente, e depois, enxugue a mancha com toalhas de papel.

Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide usando um microscópio de luz com uma lente objetiva de óleo de 100X.

Para iniciar este protocolo de coloração, primeiro coloque o equipamento de proteção pessoal correto e, em seguida, certifique-se de que as lâminas de vidro que serão usadas estejam limpas.

Em seguida, prepare as soluções. Para fazer 1% de solução violeta cristalina, misture 0,25 gramas de pó violeta cristal com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Em seguida, prepare 1% de solução vermelha congolesa misturando 0,25 gramas de pó vermelho congolês com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Agora, pipeta 10 microliters da solução vermelha do Congo para o slide. Usando uma ponta de pipeta limpa e estéril, selecione uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Em seguida, esfregue a colônia bacteriana no corante para produzir uma camada fina e uniforme. Seque completamente o deslizamento bacteriano por 5-7 minutos. Uma vez que o slide esteja seco, inunde a mancha com violeta cristalina suficiente para cobrir a mancha e deixe-a sentar por 1 minuto. Agora, segure o slide em um ângulo e esguiche suavemente um fluxo de água na parte superior do escorregador, tomando cuidado para não esguichar as bactérias diretamente. Continue segurando o slide em um ângulo de 45 graus até que o ar seque completamente. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide usando um microscópio de luz com um objetivo de óleo de 100X.

Para realizar a coloração do endosporo, primeiro, prepare uma solução verde malachite de 0,5%, misturando 0. 125 gramas de pó verde malachite com 25 mililitros de água destilada e, em seguida, vórtice da solução até dissolver. Em seguida, pipeta 10 microliters de 1X PBS no centro do slide. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Esfregue as bactérias no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Agora, coloque o slide na parte superior do banco, e deixe-o secar completamente. Uma vez seco, acenda um bico de Bunsen para aquecer as bactérias. Passe o slide através da chama do queimador azul várias vezes, com o lado da bactéria voltado para cima. Em seguida, uma vez que o slide tenha esfriado, coloque um pedaço de papel da lente pré-cortada sobre a mancha fixa de calor. Em seguida, ligue uma placa quente para o ajuste mais alto, e leve um béquer de água para ferver.

Saturar o papel da lente com a solução verde malachite e, usando pinças, coloque o slide em cima do béquer de água fervente para vapor por 5 minutos. Mantenha o papel da lente úmido adicionando mais corante, uma gota de cada vez, conforme necessário. Em seguida, novamente usando pinças, pegue o slide do béquer e remova e descarte o papel da lente. Deixe o slide esfriar por 2 minutos. Trabalhando sobre a pia, segure o escorregador em um ângulo e esguiche suavemente um fluxo de água no topo do slide. Agora, segure o nível de slides e aplique safranin para cobrir completamente o slide. Então, deixe-o ficar em pé por 1 minuto. Em seguida, segure o slide em um ângulo e enxágue como mostrado anteriormente. Deixe o slide secar no topo do banco. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide com um microscópio leve, com um objetivo de óleo de 100X.

No protocolo de coloração Gram, duas manchas coloridas diferentes podem resultar. Manchas roxas escuras indicam que as bactérias são Gram-positivas, e que elas retiveram a mancha violeta cristalina. Em contraste, a coloração rosa-avermelhada é uma característica das bactérias Gram-negativas, que em vez disso serão coloridas pela mancha de balcão safranin. Além disso, diferentes formas e arranjos de bactérias podem ser visualizados após a coloração do Gram. Por exemplo, é possível diferenciar Cocci, ou bactérias redondas, do Bacilo em forma de vara, ou identificar bactérias que formam fios, em comparação com aquelas que normalmente se agregam como aglomerados, ou ocorrem de forma cansa.

Em uma imagem de microscópio manchada de cápsula, as células bacterianas normalmente serão manchadas de roxo, e o fundo do slide deve ser manchado escuramente. Nesse fundo escuro, as cápsulas das bactérias, se presentes, aparecerão como um halo claro ao redor das células.

Por fim, na coloração do endosporo, as células vegetativas serão manchadas de vermelho pela mancha do balcão safranin. Se os endosporos estiverem presentes na amostra, estes reterão a mancha verde malachita e aparecerão em cor verde-azulado.

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Applications and Summary

As bactérias têm características distintas que podem auxiliar em sua identificação. Algumas dessas características podem ser observadas por coloração e microscopia de luz. Três técnicas de coloração úteis para observar essas características são coloração de Gram, coloração de cápsulas e coloração de Endospore. Cada técnica identifica diferentes características das bactérias e pode ser usada para ajudar os médicos a recomendar tratamentos para pacientes, identificar potenciais contaminantes em amostras ou produtos alimentícios e verificar a esterilidade da amostra.

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References

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Madigan, M. T. and J. M. Martinko. Brock Biology of Microorganisms, 11^th edition. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey. (2006).
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Anthony, E. E. Jr. A note on capsule staining. Science 73(1890):319-320 (1931).
Finegold, S. M., W. J. Martin, and E. G. Scott. Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology, 5^th edition. The C. V. Mosby Company, St. Louis, Missouri. (1978).
Gerhardt, P., R. G. E. Murray, W. A. Wood, and N. R. Krieg. Methods for general and molecular bacteriology. ASM Press, Washington, DC. (1994).
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Transcript

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As bactérias são organismos vivos microscópicos que têm muitas características distintas, como forma, arranjo de células, se produzem ou não cápsulas, e se formam esporos. Todas essas características podem ser visualizadas pela coloração e auxiliam na identificação e classificação de diferentes espécies bacterianas.

Para examinar as duas primeiras características da forma e arranjo celular, podemos usar uma técnica simples chamada coloração gram. Aqui, a violeta cristalina é aplicada a bactérias, que foram fixadas a calor em um slide. Em seguida, a solução de iodo da Gram é adicionada ao slide, resultando na formação de um complexo insolúvel entre o cristal violeta e a solução de iodo do Gram. Um descolorador é então aplicado e qualquer bactéria com uma espessa camada peptidoglycan manchará o roxo, pois esta camada não é facilmente penetrada pelo descolorador. Essas bactérias são referidas como Gram positivo.

As bactérias gram negativas têm uma camada peptidoglycan mais fina e vão descolorir o descolorador, perdendo a cor roxa. No entanto, eles vão manchar rosa-avermelhado quando uma mancha de contador safranin é adicionada, que se liga a uma camada de lipopólise em seu lado externo. Uma vez manchadas, as células podem ser observadas para morfologia, tamanho e arranjo, como em cadeias ou aglomerados, o que auxilia ainda mais na classificação e identificação.

Outra técnica útil no kit de ferramentas do microbiologista é a mancha de cápsula, usada para visualizar cápsulas externas que circundam alguns tipos de células bacterianas. Devido à composição não iônica das cápsulas e à tendência de repelir manchas, métodos simples de coloração não funcionarão. Em vez disso, é utilizada uma técnica de coloração negativa, que primeiro mancha o fundo com um corante ácido, como o vermelho congolês, antes que as células bacterianas sejam manchadas com violeta cristalina. Isso deixa qualquer cápsula presente como um halo claro ao redor das células.

A técnica final de coloração principal abrangida aqui pode ajudar a determinar se as bactérias que estão sendo estudadas formam esporos. Em condições adversas, algumas bactérias produzem endosporos, estruturas dormentes, resistentes e não reprodutivas, cuja função primária é garantir a sobrevivência de bactérias através de períodos de estresse ambiental, como temperaturas extremas ou desidratação. No entanto, nem todas as espécies bacterianas fazem endosporos, e são difíceis de manchar com técnicas padrão porque são impermeáveis a muitos corantes. O método Schaeffer-Fulton usa mancha verde malachita, que é aplicada às bactérias fixadas em um slide. O slide é então lavado com água antes de ser manchado com safranin. As células vegetativas aparecerão em vermelho-rosa, enquanto os endosporos presentes aparecerão verdes. Neste vídeo, você aprenderá como executar essas técnicas comuns de coloração bacteriana e, em seguida, examinará as amostras de coloração usando microscopia leve.

Para iniciar o procedimento, amarre os cabelos longos e coloque os equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco e luvas.

Em seguida, limpe um novo slide de microscópio com um lenço de laboratório. Em seguida, pipeta 10 microliters de 1X fosfato tamponado soro fisiológico no primeiro slide. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Esfregue a colônia bacteriana no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Coloque o slide na parte superior do banco e deixe-o secar completamente.

Uma vez seco, acenda um bico de Bunsen para aquecer as bactérias. Usando pinças, passe o slide através da chama do queimador várias vezes, com a bactéria de lado para cima, tomando cuidado para não segurar o slide na chama por muito tempo, o que pode distorcer as células.

Agora, trabalhando sobre a pia, segure o nível de slides e aplique várias gotas de violeta cristalina de Gram para cobrir completamente a mancha bacteriana e, em seguida, coloque o slide no banco para ficar por 45 segundos. Em seguida, segure o slide em um ângulo, e esguiche suavemente um fluxo de água na parte superior do escorregador, tomando cuidado para não esguichar a mancha bacteriana diretamente. Agora, segurando o nível de slide novamente, aplique a solução de iodo do Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas e, em seguida, deixe-a ficar por mais 45 segundos. Em seguida, enxágue cuidadosamente o iodo do slide, como mostrado anteriormente. Enquanto segura o slide em um ângulo, adicione algumas gotas do descolorizador de Gram ao slide, permitindo que ele corra sobre as bactérias manchadas, apenas até que o escore esteja limpo, por aproximadamente 5 segundos. Imediatamente, enxágue com água como mostrado anteriormente. Isso limitará o excesso de descoloração da mancha. Em seguida, segurando o nível de slide novamente, aplique a contra-mancha safranin de Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas. Após 45 segundos, enxágue suavemente a safranina do escorregador com água, como mostrado anteriormente, e depois, enxugue a mancha com toalhas de papel.

Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide usando um microscópio de luz com uma lente objetiva de óleo de 100X.

Para iniciar este protocolo de coloração, primeiro coloque o equipamento de proteção pessoal correto e, em seguida, certifique-se de que as lâminas de vidro que serão usadas estejam limpas.

Em seguida, prepare as soluções. Para fazer 1% de solução violeta cristalina, misture 0,25 gramas de pó violeta cristal com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Em seguida, prepare 1% de solução vermelha congolesa misturando 0,25 gramas de pó vermelho congolês com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Agora, pipeta 10 microliters da solução vermelha do Congo para o slide. Usando uma ponta de pipeta limpa e estéril, selecione uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Em seguida, esfregue a colônia bacteriana no corante para produzir uma camada fina e uniforme. Seque completamente o deslizamento bacteriano por 5-7 minutos. Uma vez que o slide esteja seco, inunde a mancha com violeta cristalina suficiente para cobrir a mancha e deixe-a sentar por 1 minuto. Agora, segure o slide em um ângulo e esguiche suavemente um fluxo de água na parte superior do escorregador, tomando cuidado para não esguichar as bactérias diretamente. Continue segurando o slide em um ângulo de 45 graus até que o ar seque completamente. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide usando um microscópio de luz com um objetivo de óleo de 100X.

Para realizar a coloração do endosporo, primeiro, prepare uma solução verde malachite de 0,5%, misturando 0. 125 gramas de pó verde malachite com 25 mililitros de água destilada e, em seguida, vórtice da solução até dissolver. Em seguida, pipeta 10 microliters de 1X PBS no centro do slide. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Esfregue as bactérias no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Agora, coloque o slide na parte superior do banco, e deixe-o secar completamente. Uma vez seco, acenda um bico de Bunsen para aquecer as bactérias. Passe o slide através da chama do queimador azul várias vezes, com o lado da bactéria voltado para cima. Em seguida, uma vez que o slide tenha esfriado, coloque um pedaço de papel da lente pré-cortada sobre a mancha fixa de calor. Em seguida, ligue uma placa quente para o ajuste mais alto, e leve um béquer de água para ferver.

Saturar o papel da lente com a solução verde malachite e, usando pinças, coloque o slide em cima do béquer de água fervente para vapor por 5 minutos. Mantenha o papel da lente úmido adicionando mais corante, uma gota de cada vez, conforme necessário. Em seguida, novamente usando pinças, pegue o slide do béquer e remova e descarte o papel da lente. Deixe o slide esfriar por 2 minutos. Trabalhando sobre a pia, segure o escorregador em um ângulo e esguiche suavemente um fluxo de água no topo do slide. Agora, segure o nível de slides e aplique safranin para cobrir completamente o slide. Então, deixe-o ficar em pé por 1 minuto. Em seguida, segure o slide em um ângulo e enxágue como mostrado anteriormente. Deixe o slide secar no topo do banco. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente ao slide e, em seguida, examine o slide com um microscópio leve, com um objetivo de óleo de 100X.

No protocolo de coloração Gram, duas manchas coloridas diferentes podem resultar. Manchas roxas escuras indicam que as bactérias são Gram-positivas, e que elas retiveram a mancha violeta cristalina. Em contraste, a coloração rosa-avermelhada é uma característica das bactérias Gram-negativas, que em vez disso serão coloridas pela mancha de balcão safranin. Além disso, diferentes formas e arranjos de bactérias podem ser visualizados após a coloração do Gram. Por exemplo, é possível diferenciar Cocci, ou bactérias redondas, do Bacilo em forma de vara, ou identificar bactérias que formam fios, em comparação com aquelas que normalmente se agregam como aglomerados, ou ocorrem de forma cansa.

Em uma imagem de microscópio manchada de cápsula, as células bacterianas normalmente serão manchadas de roxo, e o fundo do slide deve ser manchado escuramente. Nesse fundo escuro, as cápsulas das bactérias, se presentes, aparecerão como um halo claro ao redor das células.

Por fim, na coloração do endosporo, as células vegetativas serão manchadas de vermelho pela mancha do balcão safranin. Se os endosporos estiverem presentes na amostra, estes reterão a mancha verde malachita e aparecerão em cor verde-azulado.

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