Inbedding van volwassen drosophilahoofden in paraffine: weefsel voorbereiden op histologie

- Om vliegen te immobiliseren voor paraffine-inbedding, duwt u de verdoofde Drosophila voorzichtig door de opening van een vliegenkraag, zodat hun hoofden gelijkmatig op het apparaat worden geplaatst terwijl ze nog steeds aan de rest van het lichaam zijn bevestigd. Voor weefselfixatie plaatst u de halsbanden in de oplossing van Carnoy. Carnoy's is een denaturerend fixatiemiddel dat bestaat uit ethanol, chloroform en azijnzuur.

Om het monster voor te bereiden op paraffine-infiltratie, droogt u het weefsel uit door de kraag over te brengen door gesorteerde concentraties ethanol. Breng vervolgens de kraag over naar methylbenzoaat, een organisch oplosmiddel. Plaats het vervolgens in een methylbenozoaat en gesmolten paraffineoplossing terwijl het wordt verwarmd om ervoor te zorgen dat de paraffine gesmolten blijft. Ga verder met een uitgebreide reeks wasstappen met alleen voorverwarmde paraffine om het methylbenzoaat te verwijderen.

Plaats vervolgens snel de kraag in een mal en giet gesmolten paraffine om deze volledig te bedekken. Zodra de paraffine is uitgehard, verwijdert u het blok uit de mal en gebruikt u een scheermesje om overtollige paraffine te trimmen. Breek de kraag af en laat de rij ingebedde hoofden in het paraffineblok achter. In het voorbeeldprotocol zien we de procedure gedemonstreerd voor de analyse van neurodegeneratieve fenotypes.

- Gebruik eerst een tang om de onderwerpvliegen bij de nek in de halsbanden te rijgen. Lijn alle hoofden in dezelfde richting uit en zorg ervoor dat er geen schade aan het hoofd of de ogen optreedt. Neem oogloze sinus oculisvliegen op willekeurige bekende posities op, zodat de volgorde van de vliegen gemakkelijk in de secties kan worden geïdentificeerd. Bovendien, als de vliegbelasting lichte of witte ogen heeft, draad roodogige vliegen met tussenpozen langs de strip om ervoor te zorgen dat er voldoende pigment aanwezig is om de dia te bevlekken.

Noteer de volgorde van de vliegen samen met het halsbandnummer als er meer dan één wordt gebruikt. Zodra een halsband klaar is, plaatst u deze gedurende 3,5 tot 4 uur in de oplossing van Carnoy. Voer een reeks ethanol-, methylbenzoaat- en paraffinewassingen uit om het vliegweefsel voor te bereiden op inbedding. Plaats vervolgens de halsbanden één per sectie in een rubberen ijsblokjesbak.

Giet voorzichtig gesmolten paraffine over de kragen en vermijd luchtbellen en laat het 's nachts uitharden. Verwijder de paraffineblokken met de kragen uit de lade. Scheid het paraffineblok van de kraag met een scheermesje en breek de kraag voorzichtig af. De lichamen blijven in de kraag terwijl de hoofden in het paraffineblok blijven.