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Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l'aide d'un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales
JoVE Journal
Biology
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JoVE Journal Biology
Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates
DOI:

11:28 min

March 31, 2012

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Chapters

  • 00:05Title
  • 01:46Transformation of E. coli with the pGEX-RhoA(G17A) Construct
  • 02:55Preparation of GST-RhoA(G17A) Beads
  • 07:50GEF Pulldown Assay with Nucleotide-free RhoA(G17A) Beads
  • 10:11Representative Pull Down Results
  • 11:03Conclusion

Summary

Automatic Translation

La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l'activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d'une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

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