Overview
Uno degli strumenti più utilizzati nella biologia moderna è la clonazione molecolare con enzimi di restrizione, che creano estremità compatibili tra frammenti di DNA che consentono loro di essere uniti tra loro. Tuttavia, questa tecnica ha alcune restrizioni che limitano la sua applicabilità per la generazione di costrutti di DNA grandi o complessi. Una tecnica più recente che affronta alcune di queste carenze è la ricombinazione, che modifica il DNA utilizzando la ricombinazione omologa (HR), lo scambio tra diverse molecole di DNA basate su tratti di sequenze simili o identiche. Insieme al targeting genico, che sfrutta l'HR endogeno per alterare il genoma di un organismo in un loci specifico, le tecniche di clonazione basate sulle RISORSE umane hanno notevolmente migliorato la velocità e l'efficacia dell'ingegneria genetica ad alto rendimento.
In questo video, introduciamo i principi dell'HR, nonché i componenti di base necessari per eseguire un esperimento di ricombinazione, inclusi organismi competenti per la ricombinazione e librerie genomiche come i cromosomi artificiali batterici (BAC). Quindi camminiamo attraverso un protocollo che utilizza la ricombinazione per generare un vettore di targeting genetico che può infine essere trasfettato in cellule staminali embrionali per generare un animale transgenico. Infine, verranno presentate diverse applicazioni che evidenziano l'utilità e la varietà delle tecniche di ricombinazione.
Procedure
La clonazione mediante ricombinazione omologa, o ricombinazione, ha notevolmente migliorato la capacità dei ricercatori di condurre ingegneria genetica ad alto rendimento. La clonazione molecolare classica richiede la digestione di vettori e inserti con gli stessi enzimi di restrizione per generare estremità compatibili per la "ricombinazione", ma soprattutto quando si cerca di isolare una regione da una sequenza più lunga, come un tratto di DNA genomico, non ci sono sempre enzimi di restrizione che taglieranno in modo univoco intorno alla regione di interesse, e non all'interno della regione o altrove nella sequenza. Evitando la necessità di questi siti di restrizione, la ricombinazione fornisce un modo molto più efficiente ed economico per realizzare costrutti di ingegneria genetica.
In questo video, introdurremo i principi della ricombinazione genetica, forniremo un protocollo generale per la ricombinazione di un vettore di targeting genetico e discuteremo diverse applicazioni di queste tecnologie.
Per prima cosa, discutiamo cos'è la ricombinazione e come può essere applicata.
La ricombinazione genetica comporta lo scambio di informazioni tra molecole di DNA. Nella "ricombinazione omologa", vengono scambiati tratti relativamente grandi di sequenze di DNA simili o identiche. Le cellule usano questo processo per riparare le rotture a doppio filamento e gli eucarioti che si riproducono sessualmente lo eseguono anche tra cromosomi omologhi durante la meiosi per aumentare la diversità genetica.
La ricombinazione omologa è stata sfruttata per una serie di scopi sperimentali, tra cui la modifica di specifici loci endogeni nelle cellule, chiamati "targeting genico". Viene anche applicato all'ingegneria dei costrutti genetici, un processo chiamato "ricombinamento", che è particolarmente utile per apportare modifiche a grandi tratti di DNA per il targeting al genoma di un organismo. Per fare questo, i ricercatori possono fare uso di "librerie genomiche", o insiemi di vettori ciascuno contenente lunghi frammenti di DNA genomico. Sono stati creati vari tipi di librerie con capacità diverse, solitamente propagate in cloni batterici, che possono essere ordinate da repository commerciali o senza scopo di lucro. Uno dei tipi più comunemente usati di libreria genomica è chiamato cromosoma artificiale batterico o BAC, che può portare una dimensione dell'inserto tra 150-350 kilobasi.
Per ricombinare un costrutto, gli scienziati hanno bisogno di un organismo in cui si verifichi la ricombinazione omologa. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è naturalmente "ricombinazione-competente" e può facilmente effettuare una ricombinazione omologa tra un vettore e un inserto. Un altro sistema comunemente applicato utilizza le proteine "rosse" del batteriofago lambda, che viene ricostituito nei batteri E. coli. I vettori possono essere ricombinati in ceppi batterici che esprimono il rosso precedentemente stabiliti, oppure un plasmide che codifica i componenti del sistema rosso può essere co-trasformato con i substrati di ricombinazione nei batteri.
Ora, passiamo attraverso un protocollo per creare un vettore di targeting genetico ricombinando.
Lo scopo di questo protocollo è quello di creare un topo geneticamente modificato con modifiche mirate a un gene specifico. In breve, le modifiche desiderate al gene di interesse sono fatte in un BAC; la sequenza modificata viene "recuperata" in un vettore di targeting e questo vettore viene trasfettato in cellule staminali embrionali per il targeting genico. Le cellule staminali possono quindi essere utilizzate per generare l'animale geneticamente modificato. Per istruzioni su questa procedura finale, fare riferimento al video di JoVE Science Education "Ingegneria genetica degli organismi modello".
Per iniziare, viene identificato e ordinato un clone BAC contenente la sequenza genomica di interesse. Successivamente, vengono progettati i bracci di omologia, o oligonucleotidi contenenti le regioni omologhe 30-50 di base. Questi oligonucleotidi sono usati come primer nelle reazioni PCR per generare le "cassette" del DNA utilizzate per modificare il gene di interesse. Queste cassette contengono tipicamente, ad esempio, geni di resistenza agli antibiotici che possono fungere da marcatori di selezione, che possono essere facilmente amplificati da molti plasmidi disponibili pubblicamente. Il clone batterico BAC viene poi trasformato, ad esempio per elettroporazione, con un plasmide che codifica i componenti del sistema Red, seguito dalle cassette contenenti il braccio di omologia. I batteri vengono quindi incubati alla temperatura appropriata per indurre la ricombinazione.
Per recuperare la sequenza modificata dal BAC, un vettore di "recupero" viene linearizzato e amplificato utilizzando primer contenenti bracci di omologia che coprono diverse kilobasi attorno al sito di modifica. Questa spina dorsale vettoriale viene trasformata nel clone batterico BAC e la ricombinazione viene nuovamente indotta. Il vettore sarà "gap-riparato" "recuperando" la sequenza appropriata dal BAC. Ciò si traduce in un vettore di targeting genico contenente la sequenza modificata di interesse, nonché regioni omologhe al DNA genomico che circondano la sequenza modificata. Questo vettore può quindi essere purificato, linearizzato e introdotto nelle cellule staminali embrionali dove il meccanismo di ricombinazione omologa endogena punterà la sequenza modificata al locus corrispondente, alterando così il genoma dell'ospite.
Diamo ora un'occhiata ad alcune applicazioni delle tecniche di ingegneria basate sulla ricombinazione.
In primo luogo, i ricercatori possono utilizzare la ricombinazione per progettare rapidamente e facilmente il genoma batterico, ad esempio, per studiare complessi proteici. Qui, una cassetta che codifica un tag di affinità peptidica sequenziale e un marcatore di selezione della resistenza alla kanamicina sono stati progettati per essere ricombinati nell'estremità 3¢ del gene di interesse. Questo vettore è stato poi introdotto in Rosso "ricombinazione competente" E. coli, e i ricombiinanti di successo sono stati isolati usando mezzi selettivi. I complessi proteici marcati sono stati purificati biochimicamente utilizzando proteine che si legano fortemente ai tag e analizzati mediante spettrometria di massa per identificare i partner di interazione della proteina di interesse.
Il ricombineramento e il targeting genico possono anche essere utilizzati per modificare il genoma di organismi parassiti, come il parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii,che causa la toxoplasmosi della malattia. In questo studio, un vettore di targeting è stato ricombinato nel lievito, dove sequenze genomiche che fiancheggiano il gene di interesse sono state posizionate attorno a un marcatore di selezione. Il vettore è stato poi linearizzato ed elettroporato nei parassiti. La diluizione limitante in mezzi selettivi è stata utilizzata per isolare i ricombinanti di successo, in cui il meccanismo di ricombinazione omologa del parassita ha sostituito la sequenza genomica con la sequenza ingegnerata, eliminando così il gene di interesse. La PCR della regione target ha confermato eventi positivi di ricombinazione.
Infine, è stata ideata una procedura nota come subcloning plus insertion, o SPI, in cui la riparazione del gap e l'inserimento della cassetta avvengono contemporaneamente, rendendo il processo di ricombinazione più semplice e flessibile. Fondamentale per il successo di questo processo è la corretta progettazione dei bracci di omologia multipla, che, fino a 180 bp, sono più lunghi rispetto alla ricombinatura convenzionale in modo da aumentare l'efficienza della ricombinazione. Dopo aver incorporato i bracci di omologia nel plasmide di subclonazione e nelle cassette di inserzione mediante PCR, sono stati trasformati insieme in un clone BAC che esprime il rosso e la ricombinazione è stata indotta. I costrutti ricombinati con successo sono stati quindi identificati mediante PCR o analisi del digest di restrizione.
Hai appena visto il video di JoVE sul ricombinamento. In questo video, abbiamo discusso i principi della ricombinazione e come possono essere utilizzati nell'ingegneria genetica, un protocollo per un progetto di ricombinazione e, infine, diverse applicazioni di queste tecniche. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
