- 00:00Overview
- 00:41Size-Exclusion Chromatography
- 02:08Operation of Size-Exclusion Chromatography
- 02:58Affinity Chromatography
- 05:11Operation of Affinity Chromatography
- 06:25Applications
- 07:30Summary
Chromatographie-basierte Biomolekül Reinigungsverfahren
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Overview
In der Biochemie werden Chromatographie-basierte Reinigungsverfahren eingesetzt, um Verbindungen aus einer komplexen Mischung zu isolieren. Zwei solche Methoden, die von Biochemikern allgemein verwendet sind Größe-Ausschluss-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Größe-Ausschluss-Chromatographie trennt eine Spalte verpackt mit porösen Korne Bestandteile einer Mischung abhängig von der Größe. Auf der anderen Seite ermöglicht eine genauere Trennung von Biomolekülen Affinitätschromatographie mithilfe einer Spalte, die der stationären Phase besteht die zielspezifischen Liganden enthält.
Dieses Video dient als Einführung in die Größe-Ausgrenzung und Affinitätschromatographie sowie die Konzepte, die sie regieren. Eine schrittweise Anleitung für die Reinigung von einem Histidin-markierten Protein von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie wird beschrieben. Anwendungen für beide chromatographischen Methoden der Biochemie und biomedizinischer Forschung werden auch profiliert.
“Chromatographie” bezieht sich auf eine Vielzahl von Methoden verwendet, um eine Komponente aus einer komplexen Mischung, ein wesentlicher Schritt, bevor ein Biomolekül Eigenschaften und Aktivitäten bestimmt werden können zu isolieren. Jede chromatographische Technik hat einen anderen Mechanismus für die Trennung, abhängig von der Probenmatrix und Zielsubstanz. Dieses Video konzentriert sich auf die Grundsätze und den Betrieb von zwei Methoden üblich, Biochemie: Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie.
Größe-Ausschluss-Chromatographie oder SEC basiert auf der Größe der Verbindungen in der Probe. Eine mobile Phase mit der Probe wird hinzugefügt, um eine Spalte mit einem porösen Material: der stationären Phase. Die Moleküle in der Probe fallen in 1 von 3 Kategorien.
Moleküle zu groß, um die Poren zu geben Reisen die kürzeste Verbindung durch die Säule. Jede Spezies mit einem Molekulargewicht über diese “Ausgrenzung Grenze” wird die Spalte gleichzeitig beendet. Moleküle klein genug, um die Poren frei geben am längsten einbehalten werden und werden beendet die Spalte zusammen. Das Molekulargewicht ermöglicht komplette Pore Eintrag ist die “Permeation Grenze”.
Nur Moleküle zwischen diesen Grenzen werden voneinander getrennt werden, da sie unterschiedliche Mengen an Zeit diffundieren in die und aus den Poren zu verbringen. Kleinere Moleküle sind mehr auf die Spalte beibehalten, weil sie mehr Zeit in der stationären Phase verbringen, während größere Moleküle innerhalb dieser Grenzen früher beenden.
Molekulargewichte über 1 bis 2 Größenordnungen fallen innerhalb dieser Grenzen. Spalten werden mit diesem im Verstand ausgewählt, oder mehrere Spalten können in Serie verwendet werden, wenn es eine breite Palette von gewünschten Verbindungen gibt.
Nun, da Sie die Theorie der SEC gesehen haben, schauen wir wie es durchgeführt wird.
Um die SEC-Vorgang zu starten, muss die Spalte mit entionisiertem Wasser und Chromatographie Puffer equilibriert. Nachdem vorbereitet, wird Puffer mit der Probe auf die Säule eingespritzt. Der Puffer wird dann mit einer low-Flow-Rate durch gedrückt. Ein Detektor überwacht, was die Spalte, um das Vorhandensein des gewünschten Analyten bestimmen beendet. Große Moleküle mit Molekulargewichten oberhalb der Ausgrenzung beenden die Spalte zur gleichen Zeit. Kleine Brüche in der Spalte werden in Röhren gesammelt. Jede Fraktion ist für die Qualität des Zielmoleküls durch Gelelektrophorese oder andere analytische Techniken getestet.
Nun werfen wir einen Blick auf Affinitätschromatographie oder AC, eines der effizientesten Mittel, Proteine zu reinigen. Viele Biomoleküle binden selektiv an bestimmte Liganden-a-Eigenschaft die AC nutzt durch die Einhaltung einer zielspezifischen Liganden an die stationäre Phase.
Wenn das Gemisch durch die Säule fließt, zuordnen Zielmoleküle der Liganden und der Rest Durchströmung. Nachdem die Mischung der Spalte durchlaufen hat, kann das Zielmolekül durch zwei Elution Methoden basierend auf Spezifität gesammelt werden.
Biospezifischen Elution kann man sagen, ein haben eine “Normal” oder “Reverse-Rolle”. In Normal-Rolle biospezifischen Elution ist ein Agent hinzugefügt, die mit der eingehalten Liganden binden mit dem Ziel Biomolekül konkurriert.
Im Gegenteil-Rolle biospezifischen Elution konkurriert ein Agent mit dem Ziel, an dem eingehalten Liganden binden. Die zweite Art der Elution, unspezifische Elution, senkt die Ziel-Ligand-Bindung durch eine Änderung der Lösung pH, Ionenstärke oder Polarität. Wenn ein Protein nicht zu einem Liganden bindet, die immobilisiert werden kann, das Protein kann ausgedrückt werden mit einem “Tag”: kurze Peptid-Sequenzen entwickelt, um an den Liganden binden.
Eine Sorte ist stillgestellte Metallionen Affinitätschromatographie, “IMAC” kurz, wo eine haftende Metall Liganden, wie Nickel oder Kobalt, Histidin Rückstände auf das veränderte Protein bindet. Durch molekularbiologische Techniken entstehen Zielproteine mit sich wiederholenden Histidin Rückstände, Polyhistidine-Tag genannt, die das Metall über den Imidazol-Seitenkette auf Histidin bindet. Einmal gebunden, das Protein kann mit kostenlosen Imidazol per Reverse-Rolle bestimmte Elution gesammelt werden und später in eine Vielzahl von downstream-Anwendungen verwendet.
Nun, da Sie die Theorie der Affinitätschromatographie gesehen haben, schauen Sie sich bitte an ein IMAC-Verfahren im Labor.
IMac kann die stationäre Phase direkt auf die Mischung der mobilen Phase und Probe, so dass die Bindung des sein-tagged Proteins hinzugefügt werden. Dieser Brei wird dann in der Spalte “” gegossen wo die nicht gebundenen Tropf zu Abfall, Verbindungen während die Gülle bleibt. Die Gülle-Container wird gespült, sammle restliche Harz und Muster, die die Spalte hinzugefügt wird.
Das Harz wird gerührt, um sicherzustellen, dass die ungebundenen Komponenten frei fließend sind. Hinzugefügt von Waschanlagen Puffer hilft ihnen weg spülen. Sobald alle ungebundenen Bestandteile entfernt wurden, wird die Abfälle mit einem Container zu sammeln, das Zielprotein ersetzt.
Puffer mit Imidazol wird hinzugefügt, gerührt und Ruhe um das Zielmolekül trennen durfte. Die Imidazol bindet an das Metall, ersetzen und die Freigabe der tagged Proteins. Das befreite Protein wird gesammelt und der Imidazol-Schritt wird wiederholt, um die gesamte Kollektion zu gewährleisten. Um die Probe weiter zu reinigen, kann SEC auf die Probe vor der Analyse ausgeführt werden.
Nun, da wir die Theorie und das Verfahren dieser beiden Techniken gesehen haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, wie, die Sie im biochemischen Bereich angewendet werden.
Ein häufiger Grund, Proteine zu reinigen ist, ihre Rolle in der Krankheit zu studieren. Mukoviszidose wird durch Mängel in der Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regler Protein oder CFTR verursacht. Nach einem Wachstum des Proteins mit einem his-Tag in der Hefe, ermöglichen Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie die Isolierung des Proteins, gefolgt von der Studie seiner Funktion.
In einigen Fällen kann das Vorhandensein eines Polyhistidine-Tags eine Proteinstruktur und beeinträchtigt dadurch seine Funktion ändern. Eine weitere gemeinsame Tag ist Maltose-bindende Protein oder MBP, die Amylose in einer Spalte gebunden binden wird. Maltose wird dann verwendet, um den Komplex zu lösen. MBP kann dann gespalten und entfernt bei SEC, reine gewünschten Proteins zu produzieren.
Sie habe nur Jupiters Video-on-Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie beobachtet. Es bedeckt die Theorie der Techniken, ging über allgemeine Verfahren und behandelt einige der Anwendungen der Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Transcript
“Chromatography” refers to a wide range of methods used to isolate a component from a complex mixture, an essential step before a biomolecule’s properties and activities can be determined. Each chromatographic technique has a different mechanism for separation, depending on the sample matrix and target compound. This video will focus on the principles and operation of two methods common to biochemistry: size-exclusion and affinity chromatography.
Size-exclusion chromatography or SEC is based on the size of the compounds in the sample. A mobile phase containing the sample is added to a column with a porous material: the stationary phase. The molecules in the sample fall into 1 of 3 categories.
Molecules too large to enter the pores travel the shortest distance through the column. Any species with a molecular weight above this “exclusion limit” will exit the column at the same time. Molecules small enough to freely enter the pores will be retained the longest, and will exit the column together. The molecular weight allowing complete pore entry is the “permeation limit”.
Only molecules between these limits will be separated from one another, as they spend varying amounts of time diffusing into and out of the pores. Smaller molecules are retained longer on the column because they spend more time in the stationary phase, whereas larger molecules within these limits exit earlier.
Molecular weights across 1 to 2 orders of magnitude fall within these limits. Columns are chosen with this in mind, or multiple columns can be used in series if there is a wide range of desired compounds.
Now that you’ve seen the theory of SEC, let’s look at how it is carried out.
To begin the SEC procedure, the column must be equilibrated with deionized water and chromatography buffer. Once prepared, buffer containing the sample is injected onto the column. The buffer is then pushed through at a low flow rate. A detector monitors what exits the column to determine the presence of the desired analyte. Large molecules with molecular weights above the exclusion limit exit the column at the same time. Small fractions from the column are collected in tubes. Each fraction is tested for the quality of the target molecule by gel electrophoresis or other analytical techniques.
Now let’s have a look at affinity chromatography or AC, one of the most efficient ways to purify proteins. Many biomolecules bind selectively to certain ligands-a property which AC utilizes by adhering a target-specific ligand to the stationary phase.
When the mixture flows through the column, the target molecules attach to the ligand, and the rest flow through. After the mixture has passed through the column, the target molecule can be collected through one of two elution methods based on specificity.
Biospecific elution can be said to a have a “normal-” or “reverse-role”. In normal-role biospecific elution, an agent is added that competes with the adhered ligand to bind with the target biomolecule.
In reverse-role biospecific elution, an agent competes with the target to bind to the adhered ligand. The second elution type, nonspecific elution, lowers the target-to-ligand binding by changing the solution’s pH, ionic strength, or polarity. If a protein does not bind to a ligand that can be immobilized, the protein can be expressed containing a “tag”: short peptide sequences engineered to bind to the ligand.
One variety is immobilized metal ion affinity chromatography, “IMAC” for short, where an adhered metal ligand, like nickel or cobalt, binds to histidine residues on the modified protein. Through molecular biology techniques, target proteins are generated with repeating histidine residues, called a polyhistidine-tag, which binds to the metal via the imidazole side chain on histidine. Once bound, the protein can be collected with free imidazole via reverse-role specific elution and later used in a wide variety of downstream applications. Now that you’ve seen the theory of affinity chromatography, let’s look at an IMAC procedure in the laboratory.
In IMAC, the stationary phase can be added directly to the mixture of mobile phase and sample, allowing the binding of the his-tagged protein. This slurry is then poured into the column, where the non-bound compounds drip into waste, while the slurry remains. The slurry container is rinsed to collect residual resin and sample, which is added to the column.
The resin is stirred to ensure the unbound components are free-flowing. Added wash buffer helps flush them away. Once all of the unbound components have been removed, the waste is replaced with a container to collect the target protein.
Buffer containing imidazole is added, stirred, and allowed to rest to unbind the target molecule. The imidazole binds to the metal, replacing and releasing the tagged protein. The freed protein is collected, and the imidazole step is repeated to ensure total collection. To further purify the sample, SEC can be run on the sample prior to analysis.
Now that we’ve seen the theory and procedure of these two techniques, let’s look at some of the ways they’re applied in the biochemical field.
A common reason to purify proteins is to study their role in disease. Cystic fibrosis is caused by defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR. After growing the protein with a his-tag in yeast, both affinity and size-exclusion chromatography allow the isolation of the protein, followed by the study of its function.
In some instances, the presence of a polyhistidine tag can change a protein’s structure, thereby affecting its function. Another common tag is maltose-binding protein or MBP, which will bind to bound amylose in a column. Maltose is then used to release the complex. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the pure desired protein.
You’ve just watched JoVE’s video on size-exclusion and affinity chromatography. It covered the theory of the techniques, went over general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
