Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ
Chapters
Summary September 15th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроРНК, предоставляя инструменты для обнаружения относительной икализации молекул белка и микроРНК. Основным преимуществом этой техники является то, что вы можете обнаружить как белок и молекулы микроРНК из той же части ткани. Этот протокол начинается с регидратации тканей, установленных на слайдах.
Разогрейте горки при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут в духовке гибридизации. Парафин должен заметно таять. Затем инкубировать слайды в стеклянной банке Coplin, содержащей коммерчески доступный клиринговый агент в течение 10 минут.
Сделай это дважды. Затем перенесите слайды с мытья на стирку для регидратации тканей. После увлажнения, инкубировать ткани в proteinase K рабочий раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
Чтобы удалить протеиназу K, мыть слайды в 1x PBS два раза. Теперь почини ткани. Во-первых, сделать резервуары на слайдах с помощью гидрофобной ручкой, чтобы нарисовать водоотталкивающий круг вокруг препаратов.
Затем нанесите 500 микролитров раствора 4%PFA в пределах барьера и инкубировать горки в дымовой капот. Чтобы удалить фиксатор, мыть горки в банке Coplin содержащие PBS в течение пяти минут два раза при комнатной температуре. Затем промойте горки в 0,13 моляра 1-метилимидазола в течение 10 минут.
Сделайте это в дымовой капот при комнатной температуре, и выполнить эту стирку в два раза. Добавить EDC фиксации, и инкубировать при комнатной температуре в дым капот в течение одного часа. Смойте горки 50-миллимолярной трис.
Чтобы подготовиться к гибридизации, сначала постройте увлажненные камеры. Загрузите два куска фильтра или бумаги в нижней части коробки, и мокрой бумаги с один-к-одному смесь формамида и 1x SSC. Затем нанесите 200 микролитров предварительно разогретого раствора гибридизации на каждый слайд и инкубировать увлажненной камерой слайдов в течение одного-трех часов при 50 градусах Цельсия.
После инкубации замените раствор гибридизации на 250 микролитров раствора зонда и накройте слайды крышкой без RNase. Старайтесь избегать захвата пузырьков воздуха под крышкой скольжения. Теперь, тщательно запечатать камеру с парафильмом, и инкубировать слайды ночь примерно на 30 градусов по Цельсию ниже температуры плавления РНК зонда.
Может потребоваться оптимизация. В дополнение к установлению правильной температуры инкубации, различные микроРНК выражаются на разных уровнях, поэтому для достижения оптимального сигнала может потребоваться оптимизация концентрации зонда. После гибридизации, выполнить стренитность моет.
Во-первых, был в 2x SSC при 50 градусах по Цельсию в течение пяти минут, или до тех пор, пока крышка скользит ослабить. Затем выполните две стирки в 2x SSC при комнатной температуре, каждая в течение пяти минут. Затем, продолжая при комнатной температуре, мыть горки в течение пяти минут в 0,2x SSC, а затем пять минут в PBST, и, наконец, пять минут в 1x PBS.
На данный момент гибриды РНК-РНК стабильны, и условия, жесткие по РНК, больше не нужны. Для обнаружения антител DIG, во-первых, прикоснуться к гидрофобных барьеров, и применить 500 микролитров блокирующего раствора в течение тридцати минут. Инкубировать горки при комнатной температуре в увлажненной камере.
Затем удалите блокирующий раствор и замените его 500 микролитров раствора антител DIG. Инкубировать горки при комнатной температуре во влажной камере в течение часа. Затем, используя банки Coplin, мыть слайды три раза в PBST в течение пяти минут за стирку.
Затем дважды промойте слайды в растворе для предварительного окрашивания в течение пяти минут. Затем перенесите слайды в банку с полипропиленом слайд-почтальоном и добавьте 20 миллилитров субстратного раствора AP. Теперь инкубировать горки при 37 градусах по Цельсию в течение шести-24 часов, защищенных от света.
При первом использовании субстрата AP важно следить за реакцией. На двухчасовых интервалах проверьте развитие цвета на слайдах с помощью микроскопа, пока не будет определено оптимальное время инкубации. Чтобы удалить избыток субстрата AP, мыть горки дважды в растворе KTBT в течение пяти минут за стирку, а затем один мыть в PBS в течение пяти минут.
Чтобы обнаружить антитела cTNT, во-первых, блокировать ткани в течение часа. Затем нанесите 200 микролитров раствора антител cTNT и инкубировать горки на ночь при 4 градусах по Цельсию во влажной камере. На следующий день, мыть слайды в банке Коплин, содержащий PBS в течение пяти минут.
Сделай это три раза. Затем нанесите 250 микролитров анти-кролика 568 антитела раствора, и инкубировать слайды в течение часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Чтобы вымыть избыток вторичного антитела, используйте три пятиминутных моет в PBS.
Затем, при желании, нанесите 250 микролитров рабочего решения DAPI и инкубировать горки на одну минуту, защищенные от света. Чтобы удалить избыток пятна DAPI, используйте две пятиминутные стирки PBS, а после стирки, смонтировать слайды. Гибридизация microRNA in-situ была оптимизирована на секциях сердца мыши с помощью скремблированной микроРНК для отрицательного контроля и SnRNA U6 в качестве положительного контроля.
Кардиомиоцит-специфическое выражение микроРНК-182 оценивалось в сердечных секциях от контроля и PlGF-переэкспрессии мышей. Мыши несли трансген PlGF под альфа-MHC промоутер, и разработали сердечной гипертрофии, вторичной по отношению к увеличению ангиогенеза, в течение шести недель трансгенной активации. Протокол окрашивания выявил повышенную экспрессию микроРНК-182 в сердцах мышей PlGF.
Далее, чтобы определить, какие типы клеток выражают микроРНК-182, те же участки были иммунотелены для CTNT. Также использовалось окрашивание DAPI. В обоих контрольных и PlGF мыши сердца разделов, микроРНК-182 был найден в ядерном отсеке CTNT-положительных клеток кардиомиоцитов.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнить микроРНАЗ гибридизации, а затем белка иммуностимунизации. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, чтобы сохранить RNAse свободных условиях в течение первого дня, во время всех шагов, ведущих к поддержке гибридизации. После этой процедуры, другие методы, такие как западная помарка в режиме реального времени ПЦР может быть выполнена, чтобы ответить на вопросы, как, каковы относительные уровни экспрессии этой конкретной микроРНК в различных тканях, или этот конкретный белок в той же части ткани.
Не забывайте, что работа с фиксаторами, такими как PFA и ADC, может быть чрезвычайно опасной. Меры предосторожности, в том числе носить перчатки и лабораторные пальто, а также с помощью дыма капюшоны, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
