Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Antigene liposomen voor generatie van ziekte-specifieke antilichamen
Summary October 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Beschreven is de voorbereiding van de antigene Liposomale nanodeeltjes en hun gebruik in stimulerende B-cel activatie in vitro en in vivo. Consistente en robuuste antilichaam reacties geleid tot de ontwikkeling van een nieuw model van de pindaallergie. Het protocol voor het genereren van antigene liposomen kan worden uitgebreid tot verschillende antigenen en immunisatie modellen.
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals hoe witte bloedcellen geactiveerd, en hoe allergieën voor individuele allergenen ontwikkelen? Het belangrijkste voordeel van dit robuuste en reproduceerbare allergiemuismodel is dat minder muizen kunnen worden gebruikt om een lagere variantie met een experimentele populatie op te leveren. Nieuwe immunotherapieën om immuunreacties te controleren vereisen robuuste muismodellen als een eerste middel om de werkzaamheid in vivo te testen.
Zo, de implicaties van deze techniek uit te breiden tot allergie immunotherapie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in allergieën, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals auto-immuniteit waarbij ongewenste antilichaamreacties een belangrijke rol spelen bij ziekten. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen vanwege gebrek aan ervaring in het werken met liposomale nanodeeltjes of een onervarenheid met de technieken die nodig zijn in het muiswerk.
Begin met het toevoegen van 2,5 molaire equivalent van de heterobifunctionele crosslinker aan het eiwit en het plaatsen van de reactie op een oscillerende shaker bij kamertemperatuur gedurende ongeveer een uur. Na een incubatie van een uur met SPDP, desalt het eiwit op een kolom geëquilibreerd in 100-millimolar natriumacetaat, en het verzamelen van de fracties. Bepaal de absorptie van 280 nanometer en verpool de bovenste fracties.
Was de kolom in PBS en voeg 25 millimolar dithiothreitol, of DTT, toe aan de gepoolde eiwitfracties voor een incubatie van vijf tot tien minuten. Meet vervolgens de absorptie van 280 en 343 nanometer van het eiwit om de berekening van de koppelingsverhouding op basis van de molariteit van eiwitten en de linker mogelijk te maken. Voer vervolgens de samengevoegde fracties van de door PBS gewassen kolom uit en verzamel de breuken voor het meten van de 280-nanometer en de bovenste fractiepooling zoals aangetoond.
Voeg het juiste volume van 100x DSPE-PEG2000-Maleimide toe aan het eiwit om een 1x, 10-voudige molaire overtollige uiteindelijke concentratie met zachte werveling te bereiken. Voer vervolgens de reactie 's nachts onder stikstof in een verzegelde ronde-bodemkolf. De volgende dag, voer het eiwit over een crosslinked dextran gel kraal kolom, en bewaar de laatste samengevoegde fracties van lipide-gekoppelde eiwit op vier graden Celsius tot het gebruik ervan.
Zodra de juiste hoeveelheid van elke lipide is berekend, combineren alle lipiden in een 12-milliliter borosilicaat glas reageerbuis, en gebruik een drie-milliliter spuit en buizen om zorgvuldig blazen de chloroform af met stikstof. Vervolgens lyophilize de oplossing met 100 microliters van DMSO 's nachts. De volgende ochtend, voeg een milliliter lipide-gekoppelde eiwit aan de 12-milliliter lipide buis, en sonicate de oplossing drie tot vier keer gedurende 30 tot 60 seconden per sonicatie in een sonicatie water bad met ten minste vijf minuten rust tussen sonicaties.
Laad na de laatste sonicatie het monster in een van de extruderende spuiten die in de extruder worden geplaatst en plaats de extruderspuit in het andere uiteinde van de extruder. De lege spuit zal vullen als de lipide wordt geëxtrudeerd door het polycarbonaat 0,8-micrometer membraan. Plaats de volledig gemonteerde extruder in een verwarmingsblok en druk de zuiger voorzichtig in om de spuit te legen.
Na de laatste extrusie, breng de liposomen in een schone flacon, en extruderen de lipiden door middel van polycarbonaat 0,2 en 0,1-micrometer membranen zoals net aangetoond. Bewaar vervolgens de liposomen op vier graden Celsius. Om de respons van B-cel op antigene liposoomactivatie te controleren, wordt 1,5 keer 10 tot de zevende splenocyten in de buffer voor het laden van calciumstromen opnieuw opgetrokken en 1,5-micromolar Indo-1 aan de cellen toegevoegd, waarbij de oplossing in de buis meerdere keren wordt omgedraaid om te mengen.
Na een 30 minuten durende waterbad incubatie bij 37 graden Celsius, beschermd tegen licht, voeg vijf keer het volume van calcium flux laadbuffer, en centrifugeren de Indo-1-gelabelde cellen. Voor B-cel gating, vlekcellen met anti-CD5 en anti-B220 antilichaam in 0,5 milliliter laadbuffer bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in verse calcium flux laadbuffer, en resuspend de pellet op een tot twee keer 10 tot de zevende cellen per milliliter van verse calcium flux running buffer voor opslag op ijs, beschermd tegen licht tot analyse.
Voeg vervolgens 0,5 milliliter cellen toe aan een afgetopte, vijf milliliter, ronde bodem, polystyreenbuis en verwarm de cellen tot 37 graden Celsius in een waterbad. Breng de buis na drie tot vijf minuten over naar een 37 graden Celsius waterarme kamer die is aangesloten op een recirculerend waterbad en laat de buis in de waterjas op de stroomcytometer lopen. Na het verzamelen van 5.000 tot 10.000 gebeurtenissen per seconde, laat de cellen 15 tot 30 seconden stabiliseren en de gegevensverwerving opnieuw starten, waarbij de gegevens gedurende ten minste 10 seconden worden verzameld om een achtergrondlezing vast te stellen.
Verwijder bij de 10-secondenmarkering de buis snel uit de stroomcytometer en voeg de juiste experimentele concentratie antigene liposomen toe. Dan, puls vortex de cellen, en lees de buis op de cytometer voor een extra drie tot vijf minuten. Om de dieren te sensibiliseren, leveren 200 microliter pinda-extract met cholera toxine via orale gavage aan elke vier tot vijf weken oude BALB / c vrouwelijke muis ontvanger een keer per week gedurende drie weken en 300 microliter van verdunde pinda-extract in de vierde week.
Op dag 28, bereid pinda-extract tot een laatste concentratie van een milligram per milliliter in PBS, en gebruik een rectale thermometer om de basistemperatuur van elk gesensibiliseerd dier te meten. Wanneer alle temperaturen zijn gemeten, dient u 200 microliter pinda-extract toe aan elke ontvanger via intraperitoneale injectie en meet u de lichaamstemperatuur met de rectale thermometer elke 15 minuten gedurende een uur na de injectie. Een dip in de lichaamstemperatuur duidt op een allergie voor pinda's.
Na het isoleren van splenocyten van de pinda-allergische muizen, gebruik dan een een-milliliter insulinespuit uitgerust met een 27-gauge, 5/8-inch naald om intraveneus injecteren 1,5 keer 10 tot de zevende van de geëxtraheerde allergische splenocyten in de staart adins van naïeve, onbezouten dieren. Een dag na adoptieoverdracht injecteer je intraveneus 200 microliter Ara h 2 antigene liposomen in de staartader van elke BALB/c-muis die de allergische splenocyten ontving. Twee weken na de liposoom injectie, boost de muizen met een i.p.
injectie van oplosbare Ara h 2, gevolgd door een 200-microliter Ara h 2 uitdaging op dag 61. Meet vervolgens de lichaamstemperaturen met de rectale sonde om de 15 minuten, zoals aangetoond. Eiwitvervoeging kan worden aangetoond door het uitvoeren van een reducerende gel met een toename van het molecuulgewicht in vergelijking met het niet-geconjugeerde eiwit.
Om de antigene liposoom-gestimuleerde B-cel calciumflux te beoordelen, poort de levende enkele cellen om de selectie van de B220-positieve CD5-negatieve B-cellen mogelijk te maken. De verhouding van Indo-1 violet versus Indo-1 blauwe fluorescentie na verloop van tijd kan vervolgens worden geanalyseerd om de hoeveelheid liposoom-geïnduceerde B-cel activering te beoordelen. De kwantificering van Ara h 2-specifieke IgE en IgG1 in het serum van pinda-extract-gesensibiliseerde muizen door ELISA geeft aan dat muizen met een verhoogde gevoeligheid die worden versterkt met Ara h 2 meetbare Ara h 2-specifieke IgE en IgG1 vertonen in hun serum.
Lichaamstemperaturen geregistreerd tijdens de Ara h 2 uitdaging blijkt dat allergische muizen aantonen verminderde lichaamstemperaturen na de uitdaging, terwijl de lichaamstemperaturen bij naïeve muizen consistent blijven. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om zorgvuldig bij te houden van de hoeveelheid lipide-gekoppelde eiwit wordt opgenomen in de liposomen, als te veel eiwit kan extrusie moeilijk maken. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals het bijhouden en sorteren van allergeenspecifieke B- en T-cellen om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe deze allergeenspecifieke cellen reageren op therapieën.
Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers in het allergieveld om nieuwe immunotherapieën te onderzoeken die allergische ziekten bestrijden met behulp van dit muismodel. Vergeet niet dat het werken met choleratoxine gevaarlijk kan zijn en dat de richtlijnen voor het gebruik ervan moeten worden nageleefd volgens uw lokale institutionele biologische veiligheidsnormen.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE