Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Samtidige undersøgelse af ansættelse af monocyt delpopulationer Under Flow In Vitro
Summary November 26th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en integreret protokol, der måler monocyt delpopulation handel under flow in vitro-ved brug af specifikke overflade markører og konfokal Fluorescens mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at udforske sekventielle rekruttering trin samt for at profilere andre leukocyt undertyper ved hjælp af andre specifikke overflade markører.
Transcript
For denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for inflammation og immunologi. For eksempel, hvad er den molekylære mekanisme leukocyt vedhæftning og trans-endotel migration. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for ubegrænset brug forskelsbehandling mellem transmigration og stærk tilsætning af monocytter til endotelmonstol.
Selv om denne metode giver oplysninger om rekruttering af monocytter på strømmen, kan den også tilpasses andre celler i hæmatopoietiske systemer såsom T-celler, B-celler eller derivater af delpopulation heraf. Efter vask, mærke den menneskelige navlestrengen endotelceller eller HUVEC med 30 mikroliter af 37 grader Celsius M199 medium suppleret med en mikromolar CMFDA i 10 minutter ved 37 grader Celsius og 5% Kuldioxid. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne med 150 mikroliter af komplet M199-medium, og kulturen inkuberes i 150 mikroliter af frisk komplet M199-medium i yderligere 30 minutter.
Derefter erstatte supernatant med 150 mikroliter af komplet M199 medium, der indeholder de relevante eksperimentelle kosttilskud og returnere dias kammer kultur til rugemaskinen i seks timer. For human PAN monocyt isolation fortyndes en frisk indsamlet blodprøve i PBS suppleret med en millimolar EDTA i et 1 til 1 forhold og omhyggeligt lag 20 ml af blodopløsningen på 20 ml massefyldegradient medium for massevis gradient adskillelse ved centrifugering. Det midterste perifere blodmonukleare cellepladelag opsamls i et nyt 50 ml rør med 40 ml PBS suppleret med 1 millimolar EDTA, og slutvolumen bringes til 50 ml med ekstra PBS-EDTA Efter optælling isoleres monocytterne med PAN monocyt isolationssættet i henhold til fabrikantens instruktion.
Og vask cellerne tre gange i M199 medium suppleret med 0,5% Kvæg Serum Albumin, eller BSA, for at fjerne eventuelle spor af EDTA. Kvaliteten af monocytisolering er afgørende for at sikre robust transmigration og vedhæftningsresultat. Det er derfor vigtigt nøje at følge producentens anbefaling af isolationen.
Opsplit pellet på en 6 gange 10 til 6 monocytter pr ml koncentration i frisk M199 medium suppleret med 0,5% BSA og opdele cellerne i en 200 mikroliter aliquot per mikrocentrifuge rør pr rekruttering assay. Derefter placere cellerne på 37 grader Celsius i 20 minutter før deres injektion i flowkammeret. For at forberede det flydende system til analysen, først indsætte en han luer stik i den ene ende af en 8 cm lang 3 mm tykt stykke silikonerør og forbinde den anden ende til en inline luer injektion sæt.
Tilslut derefter luerstikket til den ene ende af et 40 cm langt 3 mm tykt stykke silikonerør. Dernæst 20 mm sprøjten i den ene ende af en 1 m lang 3mm tykt stykke silikonerør og indsætte en han luer stik til den anden ende. Derefter sættes begge hanlumerstik i en hunlumerlåskok og læg den frie ende af silikoneslangen i et reservoir på 37 grader Celsius M199-medium suppleret med 0,5 % BSA.
Træk stemplet tilbage for at fylde slangen med flowbufferen, og fastgør sprøjten på sprøjtepumpen. Indstil derefter pumpen til træktilstanden, og angiv strømningshastigheden. For at forbinde slidekammeret skal silikoneslangen klemmes rundt om den kvindelige luerlåskobling og koble de to luerstikhaner fra koblingen, så de kan tilsluttes reservoiret på diaset.
Luftbobler forstyrrer ikke kun billedkvaliteten, men fremkalder også kapillær ren og skær stress til cellerne, hvilket fører til celledød. For at undgå luftbobler skal du bekræfte den korrekte fastspænding af slangen, før lueren sættes ind i beholderen. Fjern derefter klemmerne for at bekræfte, at forbindelsen ikke lækker, og sæt diaset under mikroskopet.
Til billeddannelse af monocytrekruttering under flow tilsættes 5 mikroliter flourescence konjugeret anti CD16 antistof og et passende nukleart farvestof til hver aliquoterede monocytter i en 10 minutters inkubation ved stuetemperatur og opsaml cellerne med en kort centrifugering. Opsvar pellet i 250 mikroliter af flow buffer og starte sprøjten pumpen. Tilføj 30 mikroliter af en monocyt suspension til et kammer af diaset og vælg 40X mål på konfokale mikroskop.
Aktiver de relevante fluorescerende lasere og bruge kammeret med den mærkede monocyt til at indstille erhvervelse parametre konfokale mikroskop Næste, skal du vælge tre synsfelter inden for en halv centimeter radius for multi position konfokal billeddannelse, og sæt en Z stak til 10 til 12 mikrometer og tiden bortfalder erhvervelse til at køre hvert minut. Efter tre minutters billeddannelse injiceres 200 mikroliter monocytter gennem inline luer injektionsporten og begynder at billedre den cellulære interaktion. Efter mindst 30 minutter skal billeddannelsen og flowet standses, og slangen klemmes, så den kan kobles fra rutsjebanen.
For at bestemme transmigrationsraten for cellerne gennem de stimulerede HUVEC'er skal du åbne billede J og tælle det samlede antal klæbende monocytter i hvert felt for at bestemme celletallet pr. kvadratmillimeter. Derefter tælle antallet af transmigrerede monocytter, der er til stede i basalplanet under endotelcellerne som identificeret ved tilstedeværelsen af en sort hulzone omkring kernen. En enkel måde at kontrollere aktivering status huvecs efter stimulation er at visualisere deres forlængelse under inflammatorisk stress.
Time lapse confocal imaging giver mulighed for visualisering af monocytterne på det apiske plan, hvor deres fænotype kan vurderes. Migrerende celler, der gennemgår transmigration, flyttes til det intercellulære celle-til-celle-kryds, før de forsvinder fra det apikale plan og dukker op igen i det basale plan. Kvantisering af monocytrekruttering over tid bekræfter, at monocyt vedhæftning efterfølges af transmigration.
Transmigrationsraten for CD16-positiv monocyt er lav, når endotelcellen kun stimuleres med TNF alpha, men øges, når endotelcellerne stimuleres med både TNF alfa og vaskulær endotelvækstfaktor eller VEGFA. HUVEC stimulation med TNF alpha og TNF alpha plus VEGFA inducerer en stigning i overholdelsen af CD14 negative T, B og NK celler, sammenlignet med CD14 positive monocytter. Desuden fremkalder HUVEC stimulation kun transmigration af monocytpopulationen, da T-, B- og NK-celler ikke transmigrerer under hverken TNF alpha eller TNF alpha plus VEGFA stimulerende tilstande.
For at udføre en optimal monocyt rekruttering analyse, er det vigtigt, at du planlægger dit eksperiment på forhånd og gøre det på samme dag. Og når du renser cellerne, skal du sørge for, at dit mikroskop er på 37 grader, så du ikke overfører cellerne til forskellige temperaturer under eksperimentet. For at lære denne procedure, alle de metoder som profilering af HUVEC cytokin og chemokine udtryk samt chemotaxis undersøgelser kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om den molekylære mekanisme, der opretholder transmigration og vedhæftning af specifikke monocyt population.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE