Visualisera och spåra endogena mRNAs i levande Drosophila melanogaster ägg kammare

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i RNA biologi området om mekanismen och funktionen av polariserade RNA lokalisering. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör realtid visualisering av endogena RNA-handel med levande vävnader. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi av RNA-relaterade sjukdomar eftersom det har en potential att avslöja nya terapeutiska mål.

Även om denna metod kan ge insikt i RNA-processer i fruktflugeäggkammaren, kan den också tillämpas på andra system som i zebrafiskar eller odlingsceller. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa på grund av de utmaningar som är förknippade med utformning och leverans av molekylära beacon rekvisita. För molekylär beacon mikroinjection, välj 40X olja mål och montera en coverslip med dissekerade äggkammaren på mikroskopet scenen.

Lokalisera en äggkammare i mitten till sent utvecklingsstadium som är korrekt orienterad för mikroinjektion. Sätt sedan upp en mikroinjektor med lämpliga injektions- och kompensationstryck. Med hjälp av mikro manipulator joystick, försiktigt sänka en nål laddad med en mikroliter av molekylär beacon lösning i oljedroppet.

Sätt spetsen i fokus mot synfältets periferi. Utför en ren funktion för att avlägsna luften från nålspetsen och för att säkerställa att det finns flöde från nålen och föra nålen till hemmapositionen. Fokusera på äggkammaren som ska mikroinjecteras och föra nålen tillbaka i fokus nära äggkammarens kant.

Utför en finjustering av z-positionen för målsättningen så att membranet som separerar follikelscellerna från sjuksköterskecellerna är i fokus. Sätt in nålen i en sjuksköterska cell för injektion av molekylära fyrar under en period av två till fem sekunder. För att säkerställa reproducerbar mikroinjektion framgång, fokusera noga på membranet separerar follikelceller och sjuksköterska celler som kommer att injiceras samtidigt som spetsen på nålen i fokus med mikro manipulatorn.

När alla molekylära fyrar har injicerats, försiktigt bort nålen och dra tillbaka den till hemläge. Ändra målsättningen till önskad förstoring för bildinhämtning. Fokusera sedan på äggkammaren under det nya målet och påbörja bildförvärvet.

För spotdetektering av de molekylära beaconsna, öppna bilderna i Bild J.Använd verktyget konvertera till ICY för att konvertera bilderna tillbaka till ICY. En skala bar kommer automatiskt överlagras på stacken. Redigera skalningsfältet via inspektörsfönstret vid behov.

Inaktivera sedan ögonikonen för skallisten under lagerfliken för att ta bort skallisten från originalstacken. Välj identifiering och spårning, detektering och dekordetektor, och bekräfta aktuell sekvensinmatningsdetektering och kanal nolla väljs för in- och förbearbetningsparametrarna respektive. För detektor, välj detektera ljuspunkt över mörk bakgrund med hjälp av kraftanvändning av 2D-våglängder för 3D endast om det inte finns tillräckligt med z-skivor i staplarna för att utföra analysen.

Välj skalor och känslighet för varje skala lägga till fler skalor för större fläckar och bekräfta att region av intresse från sekvens är inställd för region av intresse. För filtrering bekräftar du att ingen filtrering har ställts in och välj lämpligt filformat under utdata. Om dekordetektorns resultat ska användas för spårningsanalys väljer du export till simbassäng.

För colocalization analys, upprepa platsidentifiering för den andra kanalen. För att spåra de molekylära beacon-fläckarna väljer du detektering och spårning, spårning, dekorspårning och kör dekordetektorn med samma parametrar som för spotdetekteringen. Klicka på uppskatta parametrar och välj önskad målrörelse i fönstret parameters estimation popup.

Klicka sedan på körspårning. Om du vill visualisera spåren väljer du identifiering och spårning, spårning och spårhanterare. För färgspårsprocessor väljer du aktivera och väljer en färg för spåren.

Från Lägg till spårprocessor väljer du tidsklipp för spårprocessorer. I fönstret check clipper anger du antalet identifieringar som ska visas före och efter den aktuella tidspunkten. Spara spårinformationen som en XML-spårfil och använd kameraikonen för att få en skärmbild av resultaten.

För att projicera stacken längs z-riktningen använder du sökfältet för att hitta insticksprogrammet och välj maximal projektion från dropdown-menyn. I inspektörsfönstret väljer du sekvensfliken, arbetsytan och rotationen för att justera bilden efter önskad orientering och få en skärmbild av den roterade bilden. Välj sedan region av intresse, 2D region av intresse, välj region av intresse form och välj region av intresse på bilden för beskärning.

Installera timestamp overlay plugin och lägga till en tidsstämpel följer instruktionerna i popup fönstret för vägbeskrivning om hur man placerar och formatera tidsstämpeln. Om du vill ändra eller lägga till tidsintervallet klickar du på Redigera i fönstret för sekvensegenskaper. Aktivera ögonikonen för att lägga tillbaka skalningslisten under lagerfliken i inspektörsfönstret.

Skaffa sedan en skärmdump av de tidsstämplingsresultat och spara bilden i både TIFF- och AVI-format. Med denna metod som visat, är det möjligt att visualisera transport och lokalisering mönster av endogena mRNAs via molekylära beacons i olika stadier av oogenesis och i synnerhet vid och efter mitten oogenesis. När individuellt injiceras i samma skede äggkammare, olika oskar specifika molekylära fyrar presentera samma mönster av lokalisering.

Molekylära fyrar injiceras i cytoplasman i en sjuksköterska cell kommer fritt diffusa i intilliggande sjuksköterska celler samt i äggcell. Således är fyrar kunna hybridisera med sina mål och generera fluorescens signaler på andra platser än microinjection webbplats. I oskar GFP transgena ägg kammare i mitten oogenesis, analys av förvärvet data visar omfattande colocalization för fluorescens signalen av genetiskt modifierade GFP taggade oskar mRNA med fluorescens signalen upptäcks med hjälp av molekylära fyrar.

Dessutom kan 5D-stackar analyseras ytterligare för att bestämma oskar mRNA-banor för långväga transport i både sjuksköterska cell och äggceller cytoplasma. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom RNA-biologi att utforska endogena moderns mRNA transport och lokalisering i Drosophila äggkammare.