Immunology and Infection
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Auswirkungen des Geschmacks Signalisierung Protein Abschaffung auf Darm-Entzündung in eine entzündliche Darm-Krankheit-Maus-Modell
Chapters
Summary November 9th, 2018
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Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von der Aufhebung der Verkos-Genen auf Immunreaktionen eine Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte entzündliche Darm-Krankheit (IBD)-Maus-Modell.
Transcript
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der entzündlichen Biokrankheit über Colitis ulcerosa und Morbus Crohn zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es verwendet werden kann, um erste anti- und proinfammatorische Effekte von Signalproteinen zu bewerten. Die Implikation dieser Technik erweitert die Untersuchung von Gas in neuen Fortschritten und Entzündungen.
Obwohl diese Methode Kann Einblicke in die genetische Wirkung auf Darmentzündung bieten. Es kann auch auf andere Faktoren wie Ernährung und Mikrobiom angewendet werden. In der Regel, Personen neu in diesem Semester wird kämpfen, weil die Verarbeitung von Krankheit Narbe Gewebe ist schwierig.
Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Sezieren und die Gewebevorbereitung Seschritte sind schwer zu erlernen, weil Mystalia und die Zellgewebestrukturen verändert werden können. Um Dextransulfat-Natrium oder DDS-Kolitis zu induzieren, ersetzen Sie das normale Trinkwasser durch 3%DSS-Lösung, fügen Sie Libidium für sieben Tage hinzu. Messung des Körpergewichts jeder Maus, des Verbrauchs der DSS-Lösung und der täglichen Werkzeugherstellung.
Am Ende der siebentägigen Behandlung, legen Sie die Maus in die Supine-Position und verwenden Sie eine kleine Schere, um einen drei Zentimeter langen Mittellinienschnitt im Bauch zu machen. Ernten Sie die Milz und messen Sie ihre Größe. Dann verwenden Sie Zange, um den Dickdarm zu heben, damit er von der umgebenden Mesentery getrennt werden kann.
Und extrahieren Sie den gesamten Dickdarm, bis das Cecum und das Rektum sichtbar sind. Transect das Gewebe am kolonosealen Rand. Und tief im Becken, um den proximalen bzw. distalen Dickdarm zu befreien.
Messen und zeichnen Sie die Länge des isolierten Doppelpunkts auf. Und verwenden Sie eine 10 Milliliter Spritze mit einer Gavage-Nadel ausgestattet, um den Dickdarm mit 10 Milliliter eiskalte PBS zu spülen, um den Kot und blutzuentfernen, bis die Leuchte klar läuft. Teilen Sie die Gewebeproben zur histologischen Identifizierung in gleich große proximale, mittlere und distale Abschnitte auf.
Und fixieren Sie das Gewebe in 4%Paraformaldehyd über Nacht bei 4 Grad Celsius. Für Hämatoxylin- und Eosinfärbung des isolierten Dickdarmgewebes tauchen die Gewebeteile am nächsten Morgen in 30% Saccharose und PBS über Nacht in einzelne 15 Milliliter-Röhren zum Kryoschutz der Proben. Am nächsten Tag, eingebettet eisern die Gewebe in optimale Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung.
Und kühlen Sie das Gewebe in minus 20 Grad Celsius, bis das ÜLG verhärtet. Legen Sie die OCT-Blöcke in den Kryostat und stellen Sie das Dickenzifferblatt auf 12 Mikrometer ein. Dann schneiden und sammeln 12 Mikrometer dicke gefrorene Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias.
Wenn alle Gewebe geschnitten sind, wärmen Sie die Dias bei 65 Grad Celsius auf einer Kochplatte für 20 Minuten. Und die erhitzten Abschnitte kurz in destilliertem Wasser waschen, bevor sie mit Hämatoxylin-Färbungslösung für fünf Minuten färben. Entfernen Sie die überschüssige Hämatoxylin-Lösung und laufen Sie fünf Minuten lang in Leitungswasser.
Und differenzieren Sie die Abschnitte mit 0,5% Salzsäure in Ethanol für 30 Sekunden, gefolgt von einer einminütigen Spülung unter fließendem Leitungswasser. Als nächstes waschen Sie die Proben für eine Minute in PBS. Gefolgt von weiteren fünf Minuten waschen unter fließendem Leitungswasser.
Am Ende der Wäsche, tauchen Sie das Gewebe in einer aufsteigenden Ethanol-Serie für 10 Sekunden pro Tauchgang. Zwei Minuten lang durch Gegenbefleckung in Eosin. Zur Austrocknung der Proben die Dias in 95% Ethanol und zwei Veränderungen von 100% Ethanol für fünf Minuten pro Tauchzeit untertauchen.
Gefolgt von der Räumung mit zwei, fünf Minuten Änderungen in Xylol. Dann punkten Sie die Gewebeschäden an den proximalen, mittleren und distalen Dickdarmen jeder experimentellen Gruppe. Für die immunhistochemische Analyse, nach dem Erwärmen der Abschnitte für 20 Minuten auf der Kochplatte, waschen Sie die Dias dreimal in PBS für 10 Minuten pro Wäsche.
Und beseitigen Sie die endogene Peroxidase mit einer 10 Minuten 3%Wasserstoffperoxid-Inkubation. Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation dreimal in PBS, wie gezeigt, und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit Sperrpuffer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann den Sperrpuffer durch den primären Antikörpercocktail von Interesse.
Für eine nächtliche Inkubation bei 4 Grad Celsius. Am nächsten Morgen die überschüssige Primärantikörperlösung ansaugen und die Dias dreimal in PBS waschen. Nach der letzten Wäsche die Dias mit dem entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörpercocktail bebrüten.
Gefolgt von der Etikettierung mit Streptavidin Meerrettich Peroxidase Komplex bei Raumtemperatur. Um die immunreaktiven Zellen zu visualisieren, beschriften Sie die Proben mit DAB, bis sich eine helle oder dunkelbraune Farbe entwickelt. Und die Abschnitte mit Hämatoxylin und 0,3% verdünntem Ammoniak gegenstainieren.
Wenn die Dias getrocknet sind, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um helle Feldbilder der Gewebeabschnitte unter einer 10-fachen Vergrößerung zu erhalten. Und verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, um die Population der markierten Immunzellen sowohl im Epithel als auch in der Lamina propria zu identifizieren und zu quantifizieren. Für die Genexpressionsanalyse in DSS-behandelten Dickdarmen extrahieren Sie RNA aus minus 80 Grad Celsius aufgetauten Kolongewebeproben nach Standard-RNA-Extraktionsprotokollen.
Und mischen Sie ein Mikrogramm mit der gesamten RNA mit 2,5 Mikroliter 20 Millimolar Oligo Desoxythymidin 12 bis 18 Primer und ein Mikroliter Moloney muriner Leukämie Virus Reverse Transkriptase. Mischen Sie nach einer 60-minütigen Inkubation bei 42 Grad Celsius einen Mikroliter der cDNA mit 0,5% Mikrolitern der entsprechenden vorwärts- und umgekehrten quantitativen PCR-Primer für die Voninteresseen und 2x fluoreszierenden grünen Farbstoff. Führen Sie dann die quantitative PCR unter den entsprechenden Parametern aus und berechnen Sie die relative Genexpression nach Standardprotokollen.
Im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen weisen Alpha-Gustducin-Knockout-Mäuse eine schwerere Kolitis mit übermäßigem Gewichtsverlust, Durchfall und Darmblutungen auf. Nach sieben Tagen DSS-Verabreichung zeigt die histologische Analyse der Dickdarmabschnitte eine verschlimmerte Gewebeschädigung innerhalb der proximalen, mittleren und distalen Dickdarmons der Knockout-Mäuse im Vergleich zu ihren Wildtyp-Gegenstücken. Diese übermäßige Immunaktivierung führt zur Induktion von Kolitis mit einer robusten Infiltration verschiedener Entzündungszellen im Knockout-Tierdarm, wie durch immunhistochemische Analyse beobachtet.
Darüber hinaus zeigt die quantitative PCR-Analyse höhere Konzentrationen von TNF-Alpha und Inferon-Gamma-Expression, aber eine niedrigere Expression von IL-5, 10 und 13, im Knockout im Vergleich zu Wildtyp-Mausdoppeln ohne Unterschied in TGF Beta-ein-Expression beobachtet. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, textorous Southvater Natriumdosierung und Demonstrationsdauer zu optimieren. Weiterleitung dieses Verfahrens, andere Methode wie die Erlangung von Kultur kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Wirkung von Entzündungen in Darmgewebe Entstehung zu verstehen.
Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Darmentzündung enthinen den Weg, die Beiträge von Genmutationen zur Schwere von Biodisease-Erodings und anderen Wirbeltieren zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheit Darmgewebe und seinen Inhalt kann extrem gefährlich sein und die Auswirkungen wie das Tragen von Dingen, die angemessen sind, persönlichen Schutz dauerhaft sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens genommen werden.
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