Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Listeria monocytogenes Infektion i hjernen
Chapters
Summary October 2nd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Under infektion er Listeria monocytogenes i stand til at krydse blod - hjerne barrieren for at kolonisere hjernen. I denne protokol vise vi, hvordan man skal vurdere bakteriel kolonisering af organer efter infektion af mus. En procedure til at udføre hele orgel perfusion for specifikke bestemmelse af bakteriel numre i hjernen parenkym er fastsat.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i bakteriel patogenese felt om, hvorvidt blodbårne bakterier kan krydse blod - hjerne barrieren til at inficere centralnervesystemet og hjernen. Med denne teknik, bakterielle tal i blod og hjernevæv af inficerede dyr kan bestemmes, mens eksklusive antallet af bakterier, der bor i blodkarrene i hjernen. Demonstration af proceduren vil være Pallab Ghosh, en forskningsmedarbejder fra mit laboratorium.
Ved 72 timer efter infektion, indstille en automatiseret perfusion system til en strømningshastighed på fire milliliter PBS suppleret med 10 millimolar EDTA per minut. Og læg det aflivede dyr i liggende position i en dissektionspande. Bekræft aflivning ved manglende reaktion på pote knivspids.
Og våd maven med 75% ethanol. Brug saks til at gøre en bugvæg snit til lige under brystkassen til at udsætte mellemgulvet og viscerale organer. Og skær mellemgulvet for at åbne brysthulen.
Skær gnide bur bilateralt at udsætte venstre hjertekammer og bruge kraftvænser til forsigtigt at forstå hjertet. Indsæt en 21-gauge sommerfugletål forbundet til perfusionssystemet i venstre hjertekammer og skær forsigtigt det højre atrium for at indsamle omkring 200 mikroliters blod i et to milliliterrør indeholdende 10 millimolar EDTA for at forhindre koagulation. Derefter gennemspøres dyret i fire minutter med 15 til 20 milliliter PBS plus EDTA.
Efter fuldstændig perfusion, hjernen og leveren vises blancheret sikre, at de resterende bakterier er fra de høstede organer og ikke det cirkulerende blod. Efter perfusion overføres interesseorganerne omhyggeligt til individuelle sterile, koniske 15 milliliterrør, der indeholder fem milliliter sterile fire grader Celsius PBS pr. rør. At høste hjernen efter halshugning, bruge en saks til at skære hovedbunden huden ned midterlinjen mellem øjnene, holde spidserne presset mod kraniet for at trimme overskydende væv efter behov.
Sæt forsigtigt en spids af saksen ind i foramen magnum og skær sidefra og ned i kraniet på begge sider. Skær forsigtigt kraniet mellem øjnene ned midterlinjen i kraniet, idet du skal passe på at anvende lateralt tryk og for at undgå ledning af hjernen. Brug scef, åbne kraniet for at udsætte hjernen og placere en spatel mellem undersiden af hjernen og bunden af kraniet til omhyggeligt at overføre hjernen til en 15-milliliter rør, der indeholder fem milliliter af fire grader Celsius PBS.
I et biosikkerhedsskab skal du indsætte spidsen og køre en vævshomogenisator i 10 sekunder i sekventielle 5%blegemiddel, sterilt vand, 75% ethanol og sterile vandopløsninger i separate 15-milliliter koniske rør. Når spidsen er blevet grundigt steriliseret, homogenisere den inficerede hjerne i sit rør. Når der ikke er synlige vævsfragmenter tilbage, steriliseres spidsen igen for at forhindre bakteriel overførsel til den næste organprøve, og homogenisere det næste organ.
Når alle organerne er homogeniseret, forberedes 10 gange serielle fortyndinger af hvert organ homogenat i steril PBS, og fortyndingerne på hjerne-hjerte-infusions-agarpladerne plader plader til pladen. Derefter inkubere homogene fortynding kulturer ved 37 grader Celsius natten og tælle antallet af kolonier på hver plade til at bestemme det samlede antal bakterier pr organ eller milliliter blod. Beregning af bakterielle byrder i L.monocytogenes-inficerede museorganer som netop påvist tyder på, at perfusion post-infektion ikke væsentligt ændre bakteriel byrde i blodet eller organer inficerede mus, der blev undersøgt i denne repræsentative undersøgelse.
Efter denne procedure, Listeria monocytogenes-inficerede organer kan yderligere behandles til yderligere analyse såsom histopatologisk behandling for at besvare yderligere spørgsmål om infiltration af inflammatoriske celler i inficerede museorganer i forhold til ikke-inficerede kontrol dyr. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at undgå liggende i hjernen og at opretholde minimal kontakt mellem saks og hjernevæv.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
