Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
В реальном времени наблюдения опосредовано Rad51 реакции обмена Strand ДНК
Chapters
Summary February 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Флуоресценции резонанс энергии на основе передачи в реальном времени наблюдения системы ДНК прядь реакции обмена опосредовано Rad51 были разработаны. Используя протоколы, представленные здесь, мы способны обнаружить формирования интермедиатов реакции и их преобразования в продукции, а также анализа ферментативной кинетики реакции.
Transcript
Этот метод может помочь расшифровать шаги в обмене нитей ДНК и показывает роль молекул различных белков, участвующих в комбинации во время ремонта. С помощью этого метода мы можем контролировать обмен нити ДНК в режиме реального времени без каких-либо нарушений реакции и использовать операционную для определения кинетики каждого шага реакции. С некоторыми незначительными корректировками, этот метод может быть применен для изучения деятельности очищенных белков рекомбинации, полученных из других видов, таких как млекопитающие и растения.
Демонстрация процедуры будет Кентаро Ито, почтовый док из моей лаборатории. Для начала подготовьте буфер реакции А в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте 36-наномол 16FA-олигонуклеотид в буфер для анализа спаривания ДНК.
Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте белок RAD-51 при конечной концентрации 1,5 микро молей в смесь и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте белок SWI5-SFR1 при конечной концентрации 0,15 микро молей в смесь и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение еще пяти минут.
Передача 1,5 миллилитров смеси в 1,0 на 1,0 см кварцевой кюветт, содержащий магнитный мешалка. Вставьте кювет в спектрофторометр и приступайте к регулировке контроллера температуры и магнитного мешалки. Запись изменения в FAM флуоресценции выбросов на 525 нанометров при возбуждении на 493 нанометров с интервалом в одну секунду в течение 100 секунд.
Наконец, со шприцем, вводить ROX помечены двойной мель ДНК в окончательной концентрации 36 нано молей в кювет. Запись изменения флуоресценции выбросов с интервалом в одну секунду в течение 30 минут. Чтобы сравнить спектры флуоресценции между субстратами и конечные продукты, вставьте каждый кюветт, содержащий 16 FA-oligonucleotides с или без RAD-51 в спектрофторометр и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Затем завездните флуоресценцию FAM на 500-600 нанометрах при возбуждении на 493 нанометров. Чтобы проверить влияние RAD-51 на спектры флуоресценции, добавьте RAD-51 при конечной концентрации 1,5 микро молей. И инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Наконец, завестить спектры флуоресценции от 500 до 600 нанометров при возбуждении на 493 нанометров. Максимальная эффективность FRET получена путем измерения максимального снижения интенсивности флуоресценции, когда все однострунные подложки ДНК преобразуются в двухструнный ДНК в анализе спаривания. Или путем измерения максимального увеличения интенсивности, когда все двухструнный субстрат ДНК преобразуется в однострунный ДНК в анализе смещения.
В обоих анализах добавление белка RAD-51 не повлияло на флуоресцентный выброс ФАМ или его эффективность закалки породами. Последствия спонтанных реакций между субстратом ДНК и последующим отбеливанием фотографий невелики. Как показали незначительные изменения в выбросах ФАМ без RAD-51, по сравнению с существенными изменениями, замеченные с RAD-51.
Добавление комплекса SWI5-SFR1 сильно стимулирует парную активность RAD-51. Реакция сопряжения моделируется с помощью трехшаговой модели, состоящей из формирования первого трехтягового промежуточного, перехода во второй промежуточный и выпуска одноявенной ДНК и формирования гетеро дуплекса. Сравнение трехшаговой модели с двухшаговой моделью указывает на то, что трехшаговая модель лучше подходит для моделирования сопряжения ДНК без или со комплексом SWI5-SFR1.
Расчетная равновесная константа каждого шага реакции, с или без SWI5-SFR1, показывает, что комплекс SWI5-SFR1 не стимулирует образование первого трехтягового промежуточного, но сильно стимулирует переход между двумя трехтягами промежуточными и высвобождением ДНК СС. Необходимо убедиться, что каждая партия очищенного белка не содержит нуклеазы и геликейсного загрязнения.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
