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Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto
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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution
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Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

DOI:
10.3791/59202-v

•

11:37 min

•

February 26, 2019

•

, , ,
1ToolGen

Chapters

  • 00:04Title
  • 01:45Positive and Negative Screening for Evolving Cas9
  • 04:47Delivery of Cas9 as an RNP with Truncated sgRNA
  • 06:17RNP Delivery
  • 07:27Transfection of Plasmids Encoding Sniper-Cas9 and sgRNA
  • 09:01Targeted Deep Sequencing for the Analysis of On-target and Potential Off-target Sites
  • 09:29Results: Analysis of Sniper-screen, On-target and Off-target Activities
  • 10:37Conclusion

Summary

Automatic Translation

Automatic Translation

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare CRISPR-Cas9 per ottenere una maggiore specificità senza la perdita di attività sul bersaglio. Utilizziamo un approccio diretto evoluzione chiamato Sniper-schermo per trovare un mutante Cas9 con le caratteristiche desiderate. Cecchino-Cas9 è compatibile con tronco singolo-guida RNAs e consegna in un formato della ribonucleoproteina, ben note strategie per conseguire maggiore specificità.

Tags

CRISPR-Cas9Off-target EffectsDirected EvolutionSniper-Cas9On-target ActivitySpecificityLibrary ScreeningTherapeutic DevelopmentCas9 VariantsY-type Cas9ElectroporationCompetent Cells

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