Neuroscience
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在Vivo直接重新编程居民胶质细胞到内神经通过病毒载体的脑内注射
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Summary June 17th, 2019
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该协议旨在利用大脑中基于AAV的病毒系统和FLEX突触素驱动的GFP报告器,在体内直接重新编程的内神经,从而在体内进行细胞识别和进一步分析。
Transcript
该协议表明，有可能直接从居民胶质产生新的神经元，这些重新编程的细胞成熟成亚型特异性神经元。主要优点是依赖 cre 的 AAV 病毒，它能够对 NG2-glia 和 GFP 报告器进行特定定位，该报告器标记重新编程的神经元进行分析。在大脑中产生新的神经元可能导致大脑细胞替代疗法的未来发展。
在我们的协议中，我们生成对精神疾病有影响的帕伐布明阳性内用神经。体内重新编程可以应用于其他大脑区域和电路，具体取决于您想要针对的神经元表型和神经系统状况。演示这个程序的将是珍妮·约翰逊：技术员，玛丽亚·佩雷拉：前博士生，马塞拉·比尔特尔：我们实验室的博士生。
为了产生AV5病毒载体，在5个T175烧瓶中用标准培养基播种 HEK293T 细胞。当细胞达到50-70%汇合时，准备以下混合进行转流。在50毫升离心管中，加入等量的矢量质粒和pDG系列帮助质粒。
将 Tris-EDTA 缓冲液添加到 144 微升的最终体积中，然后加入超纯水，使总体积达到 1296 微升并混合。接下来，加入144微升2.5摩尔氯化钙并混合。之后，立即将1.92毫升的HBS加入DNA溶液和涡流。
在室温下孵育60秒。随后，将溶液转移到28毫升的新鲜细胞培养中并混合。将烧瓶中的介质替换为含有转流混合物的介质。
等三天，把媒体转废了。在每个烧瓶中加入五毫升的收获缓冲液，然后在每个烧瓶中再添加四毫升的 DPBS，以冲洗剩余的细胞，并用细胞溶液池。将收获的细胞以1000xg离心，在4摄氏度下5分钟。
离心后，去除上流液，将颗粒溶解在15毫升的解解缓冲液中。将50毫升离心管冷冻在干冰上15分钟，并存放在零下20摄氏度的冰柜中。使用前，在37摄氏度的水浴中解冻收获的细胞。
在该过程中，通过碘沙醇梯度超离心进行 AAV 纯化，并在室温下使用离心度为 35 万 x g 的超离心吊管，使用 1 小时 45 分钟。要提取包含相的 AAV，请插入一个 10 毫升注射器，用 18 个量表针在 40 至 60% 相边界以下约 2 毫米，斜面朝上并退出。在提取了五到六毫升的病毒载体后，确保在到达蛋白质带之前停止。
然后，通过心安酸交换过滤器，通过不快于一滴的速度推动稀释的碘盐梯度，进行净化和浓缩。随后，缓慢地将三毫升的 IE 缓冲液通过过滤器进行清洗。接下来，将混合物用一到两毫升洗脱缓冲液将混合物倒入离心过滤单元中。
将 DPBS 添加到设备，最终体积为四毫升。在室温下以 2，000 x g 为单位的离心机，直到低于 0.5 毫升的 DPBS 留在过滤器中。之后，从管底取出液体，重新加注四毫升 DPBS，然后再次离心。
再重复此步骤两次，确保滤波器上的集中矢量体积在上次离心后约为 200 微升。使用移液器拆下 200 微升浓缩矢量，并通过 0.22 微米过滤器将其推至灭菌。接下来，将 200 微升等同物放入带联锁刀片的玻璃瓶中。
要注入重新编程因子，请将麻醉小鼠放在立体轴框架中。在手术开始时进行适当的镇痛，然后将注射针的玻璃毛细管的尖端放在呼吸管的正上方。确保毛细管尖端在 A-P 和 M-L 平面上完全直。
在数字坐标计数器上将 M-L 和 A-P 值重置为 0.0。要确保动物的头部处于完全平坦的位置，当 A-P 臂位于正 2.0 和减 2.0 以及 M-L 臂位于正 2.0 和减 2.0 时，使用数字坐标计数器测量 D-V 坐标值。相应地调整齿杆和耳杆的高度。
之后，稍微抬起注射器，在注射坐标处使用牙科钻孔钻孔。开始在现场钻孔，以循环和温和的方式工作。然后，将一块棉纱布放在打开的切口上，然后用盐水溶液冲洗注射器。
冲洗后，绘制一个气泡，然后一个微升溶液含有病毒载体。确保病毒溶液在气泡下方易于可视化。接下来，降低注射器，缓慢地向所需深度前进，并确保轨迹远离骨骼碎片。
随后，以每分钟0.4微升的速度注射一微升病毒溶液。注射完成后，在注射器提取前留出两分钟进行扩散。扩散后，慢慢缩回注射器，直到毛细管的尖端完全从大脑中撤出，然后小心缝合切口，将动物从立体气框架中取下。
在术后站中监测动物，直到恢复知觉。动物在病毒注射后被保存长达12周，以允许居民胶质重新编程成成熟的神经元。为了使用振动器为电生理学准备脑片，请将大脑从最旋转的部分分到高速的石质水平。
然后以275微米的速度以0.1毫米/秒的速度将花段分段。每个节后，小心地去除非注射的石室侧，将注射侧转移到小瓶中，并用底网和氧化 CREB 感应在室温下在水浴中滑动。将小瓶保持室温，直到所有部分被切割。
之后，慢慢将水浴的温度升高到37摄氏度，并离开30分钟，然后关闭加热器，让它冷却到室温。将一个组织部分转移到电生理学记录室后，将玻璃移液器安装在记录电极上，然后将其降低至溶液中。仔细检查电极的电阻。
然后，使用移液器缓慢接近重新编程的细胞，在电极中保持轻微的正压，以避免堵塞尖端，并在修补前检查该电池的 GFP 阳性。修补电池时，将电流夹的细胞从负 60 到负 70 毫伏，并注入 500 毫秒电流，从负 20 注入到正 90 皮奥安培，并注入 10 皮奥安佩雷增量以诱导作用电位。这表明神经元成熟和成功的重新编程。
随后，切换到电压夹并测量向内钠，并在 10 毫伏的降极步下延迟校正钾电流。这里是一个后记录生物细胞素填充重新编程神经元，显示成熟的神经元形态和树突状脊柱。在这里，重新编程的神经元的电生理记录显示，与自发活动措施存在术后功能连接。
跟踪显示抑制活性被阻断与皮罗毒素， GABAA受体拮抗剂和兴奋活性被阻塞与CNQX， AMPA受体拮抗剂.修补的神经元在注射后五周已经显示注射后活动，注射后8周和12周继续。具有当前诱导作用潜力的神经元数量也会随着时间的推移而增加。
更详细的分析揭示了几种不同的发射模式，其中大多数细胞表现出类似于帕瓦尔布明内维龙的快速尖峰活动。免疫石化学分析在12周进一步显示共同表达记者GP和帕瓦尔布明。按照此过程，您可以使用贴片查找技术检查基因表达，或评估具有单突触追踪和 iDISCO 的三维突触连接。
现在，有可能重新编程居民胶质到帕瓦尔布明表达实习，我们已经开始调查这些是否是真实的，可以用作治疗工具。在处理动物和使用 AAV 病毒时，请记住遵循既定的协议和准则。
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