Developmental Biology
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Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana
Chapters
Summary July 26th, 2019
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La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.
Transcript
Sia la biopsia blastocisti che la vetrificazione sono state una rivoluzione nella fecondazione in vitro, nella fecondazione in vitro, consentendo agli embriologi di tutto il mondo di eseguire test genetici preimpianto su embrioni umani con un rischio minimo per l'embrione. La biopsia del trophectoderm ha permesso il recupero di circa sette cellule da un embrione completamente cresciuto, consentendo così una solida analisi genetica a valle. Inoltre, finora non è stato dimostrato alcun impatto su questo approccio.
L'efficienza clinica di questo flusso di lavoro consente ai pazienti con condizioni monogeniche e a tutti quei pazienti con un aumento del rischio di anomalie cromosomiche all'interno della loro blastocista di beneficiare di test genetici preimpianto. C'è ancora spazio per migliorare le attuali strategie di selezione degli embrioni. Ad esempio, la profilazione miRNomica e proteomica rappresenta opzioni intriganti per integrare i test genetici di preimpianto su una singola biopsia del trophectoderm.
Gli operatori inesperti spesso faticano ad aprire e penetrare la zona pellucida. È solo una questione di concentrazione. La blastocista, l'obiettivo laser e le pipette dovrebbero essere sullo stesso piano focale.
Dopo aver etichettato il piatto di biopsia con i dettagli del paziente, con un marcatore permanente e atossico, numera ogni goccia di 10 microliter di mezzo tamponato con HEPES con l'ID embrione e ciclo.Utilizzando una pipetta di stripping di 300 micrometri, trasferisci una blastocista vitale e completamente espansa alla prima goccia del piatto di biopsia e risciacqua la goccia per rimuovere il mezzo di coltura in eccesso, prima di spostare la blastocista nella seconda goccia nel piatto. Posizionare il piatto al microscopio invertito e innescare la pipetta di biopsia con il mezzo dalla terza goccia del piatto di biopsia. Sotto un ingrandimento 20 volte, orientare la blastocista per ottenere una visione chiara della massa cellulare interna a ore sette e fissare l'embrione sulla pipetta di tenuta.
Concentrati sulla zona pellucida in modo che sia le pipette che la blastocista siano sullo stesso piano focale. Passare all'obiettivo laser e posizionare il puntatore laser sulla zona pellucida sul lato opposto della massa interna della cella. Perforare la zona pellucida con due o tre impulsi laser e premere delicatamente la pipetta di biopsia contro la zona pellucida per consentire al mezzo di soffiare attraverso la breccia per staccare le cellule del trophectoderm dalla superficie interna.
Quando il trophectoderm è staccato, entra attraverso il foro e aspira da sette a otto cellule trophectoderm nella pipetta biopsia con delicata aspirazione. Durante l'applicazione di un'aspirazione moderata per allungare le cellule bersaglio, spostare leggermente la pipetta di biopsia all'indietro e dirigere il laser verso la parte più sottile delle cellule aspirate. Spara da due a cinque impulsi laser alle giunzioni tra le cellule per separare le cellule bersaglio dal corpo dell'embrione.
Quando il frammento di trophectoderm è stato separato dalla blastocista, rilascia il frammento nella stessa goccia di biopsia lontano dalla blastocista per evitare che il frammento venga risucchiato nella pipetta della biopsia. Rilasciare la blastocista dalla pipetta di tenuta e sollevare prontamente entrambe le pipette per evitare che il frammento si attacchi alle pipette. Quindi immagine del frammento biopsied per scopi di controllo qualità.
Quando tutte le blastoc cisti sono state biopsiate come appena dimostrato, spostare il piatto di biopsia nel cappuccio di flusso laminare ed etichettare il piatto di coltura post-biopsia con l'ID coppia e ogni goccia con l'id embrione e ciclo. In presenza di un testimone, sciacquare la blastocista in un mezzo di fecondazione in vitro pulito e spostare la blastocista alla corrispondente goccia nel piatto post-biopsia. Quindi posizionare il piatto post-biopsia su un'incubatrice di 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e 5% di ossigeno.
In presenza del testimone e all'interno di una cappa di flusso laminare a temperatura ambiente, etichettare i tubi PCR con un marcatore permanente e atossico. Etichettare il coperchio di un piatto di coltura di tubi da 60 x 15 millimetri con gli ID embrionale biopsied e aggiungere due gocce da 10 microlitri di soluzione di lavaggio della biopsia al piatto. Innescare una pipetta di stripping di 140 micrometri con soluzione di lavaggio della biopsia dalla seconda goccia della piastra del tubo sotto il microscopio stereo per visualizzare i frammenti di trophectoderm.
Rilasciare delicatamente una soluzione di lavaggio della biopsia sul frammento di trophectoderm e caricare il frammento nella pipetta di stripping. Spostare il frammento nella seconda goccia di soluzione di lavaggio della biopsia e sciacquare accuratamente il tessuto da due a tre volte. Trasferire il frammento di trophectoderm sul fondo del tubo PCR opportunamente etichettato con soluzione di carico, facendo attenzione a evitare di toccare le pareti del tubo con la punta della pipetta di stripping.
Quando tutti i frammenti sono stati aggiunti ai loro tubi, ruotare tutti i tubi in una mini centrifuga per alcuni secondi per sedimentare i frammenti. Quindi conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino a quando non vengono spediti al laboratorio genetico di riferimento per i test. Entro 30 minuti dalla biopsia del trophectoderm, etichettare una piastra di vetrificazione con i dettagli del paziente e gli ID delle blastocsti che devono essere vetrificate.
Utilizzando speciali crioetichetiche resistenti alla temperatura fredda, etichettare i supporti di vetrificazione con il nome e il cognome del paziente, l'ID coppia, l'ID dell'embrione che verrà caricato su di esso e la data della procedura. A temperatura ambiente, erogare 300 microlitri di soluzione di equilibrazione per ogni blastocisti che sarà vetrificato e, in presenza di un testimone, utilizzare una pipetta di stripping di 300 micrometri per spostare la blastocisti in un unico volume di soluzione di equilibrazione. Lasciare la blastocista nella soluzione di equilibrazione per 13-15 minuti.
Dopo un iniziale restringimento del volume, si osserverà una graduale espansione. Al termine dell'equilibrazione, aggiungere 300 microlitri di soluzione di vetrificazione al secondo pozzo della piastra di vetrificazione e trasferire la blastocisti completamente ri-espansa alla soluzione di vetrificazione per un minuto. Al termine dell'incubazione, sciacquare la blastocista per diluire la soluzione di equilibrazione e, in presenza di un testimone, caricare la blastocista sul supporto di vetrificazione.
Rimuovere l'eccesso di soluzione di vetrificazione. Un sottile film di soluzione dovrebbe circondare la blastocista. Immergere il supporto di vetrificazione in azoto liquido e spostare vigorosamente il supporto per ridurre il rischio di formazione di bolle vicino al campione.
Quindi posizionare il cappuccio protettivo sul supporto mentre il supporto di vetrificazione è ancora immerso nell'azoto liquido. Delle 1.544 procedure di biopsia del trophectoderm condotte in questo periodo rappresentativo di due anni, da una a quattro blastocista sono state biopsiate per procedura per un periodo compreso tra i tre e i 22 minuti per procedura. In questi grafici viene mostrata la tempistica media della biopsia per ogni operatore lungo i trimestri di studio, con un valore complessivo medio di 8,24 minuti.
È utile acquisire un'immagine di ogni frammento biopsied ai fini del controllo di qualità per valutare se la causa delle diagnosi inconcludenti fosse imputabile alla dimensione e/o alla qualità del frammento, ai tubi o ad alcuni problemi nella lavorazione del campione in laboratorio genetico. In questo studio, 572 blastocici euploidi sono stati riscaldati per sottoporsi a un trasferimento di embrioni dopo una diagnosi di euploidia. Tutte le blastoc cisti vetrificate in 30 minuti, con il 2,4% delle blastocsti che non si espande tra i 31 e i 90 minuti e il 4,9% non si ri-espande oltre i 90 minuti dal riscaldamento.
Soprattutto per le blastocista di scarsa qualità e/o settima giornata, la tempistica tra biopsia e vetrificazione sembra cruciale per ottenere una espansione dopo il riscaldamento. Fare attenzione a mettere a fuoco prima di aprire la zona pellucida quando si espone la giunzione tra la cellula trophectoderm e la cottura, e fare attenzione anche a prevenire la rielezione della blastocista prima della vetrificazione. Esistono altri due approcci di biopsia blastocisti, che comportano sia l'apertura della zona pellucida che l'attesa di un arco spontaneo delle cellule del trophectoderm.
Questi approcci sono più semplici ma richiedono più manipolazioni e richiedono più tempo. L'efficacia di questo flusso di lavoro consente l'implementazione di tecnologie molecolari in fecondazione in vitro al fine di cercare di selezionare la blastocista con la più alta probabilità di impianto prima del trasferimento dell'embrione. Ricorda di non utilizzare alcun dispositivo o soluzione che possa essere tossico per gli embrioni e di prevenire la contaminazione da DNA utilizzando materiali senza DNA.
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