Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning af ekstravaskulære Trypanosoma -parasitter ved fin nåle aspiration
Chapters
Summary August 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fin nål aspiration er en teknik, hvorved celler er opnået fra en læsion eller orgel ved hjælp af en tynd nål. Aspireret materiale er smurt, plettet og undersøgt under et mikroskop til diagnosticering eller anvendes til molekylær biologi, cytometri eller in vitro-analyse. Det er billigt, enkelt, hurtigt og forårsager minimal traume.
Transcript
Fin nål aspiration cytologi er en billig, enkel, hurtig og minimalt invasiv teknik, som vi bruger til at indsamle trypanosomes fra håndgribelige læsioner i organer i levende mus. Da fin nåleaspiration er en ikke-terminalprocedure, giver den mulighed for gentagen prøveudtagning hos det samme dyr over tid. Hvis disse resultater kan oversættes til kvæg, vil denne metode være meget nyttigt for dyrlæger at diagnosticere trypanosomiasis hos kvæg i en gård.
Demonstrere udtværing farvning procedure vil være Ana Margarida Santos, en assisterende teknolog fra mit laboratorium. Til at begynde, bekræfte bedøvelse med tå knivspids metode. Når refleksen af tilbagetrækningen af benet er fraværende, skal du placere musen i dorsal recumbency.
Palper forsigtigt testiklerne for at bestemme størrelsen og afstanden fra den overliggende hud og derefter begrænse den mellem pege-og langfingeren eller mellem pegefingeren og tommelfingeren. For yderligere at immobilisere målet, strække den overliggende hud stramt og rense overfladen med alkohol klude. Dernæst indsætte nålen spidsen af en 23 gauge nål forbundet til en fem milliliter sprøjte i målet og sørg for stemplet er i hvile tilstand.
For at påføre suge, trække sprøjten stemplet til de tre til fire millimeter mærke to til tre gange. For at øge sandsynligheden for at opnå en repræsentativ prøve og for at målrette mindre strukturer som epididymis, omdirigere nålen i orglet enten i en lige linje eller langs flere forskellige tangenter. Slip sugningen ud og træk derefter nålen tilbage.
Nålen kan kun fjernes, når undertrykket slippes ved at give slip på stemplet. Ellers bliver aspiratet suget ind i sprøjten og kan ikke gendannes. Tryk med en steril gazesvamp på punkteringsstedet for at kontrollere blødningen.
Tag sprøjten ud af nålen og fyld den med luft. Tilslut nålen igen, læg spidsen af nålen meget tæt på eller endda på rutsjebanen, og skub forsigtigt indholdet af nålen ud på rutsjebanen. For at sikre replikatprøvetagning skal der udføres mindst én yderligere aspirationspert organ og dyr.
Efter at have vendt anæstesi med en subkutan injektion af 200 mikroliter på 1 milligram pr. kg Atipamezole i saltvand, returnere dyr til deres hjem bur til nyttiggørelse. Brug den ikke-dominerende hånd til at tage det dias op, der har dråben af aspirate, der klemmer den matterede ende mellem tommel- og pegefingeren. Brug den dominerende hånd, afhente en ren spreder dias og placere den glatte rene kant på tværs af det andet dias lige på toppen af dråben i en vinkel på ca 30 grader.
For at opnå en tynd film skal du glide glide glide fremad med en lys kontinuerlig og stabil bevægelse. Lad rutsjebanen hvile og muliggøre en komplet og hurtig lufttørring af materialet. Mærl den matterede kant af diaset med en blyant.
For Giemsa farvning protokol, fastsætte lufttørrede udstrygninger ved nedsænkning dias i en Coplin krukke, der indeholder 100% methanol i fem minutter. Overfør derefter diasene til en Coplin krukke med 20% Giemsa opløsning og destilleret vand i 30 minutter. Skyl rutsjebanerne i postevand og dup med silkepapir for at tørre grundigt.
Mens du holder diaset vandret, anvende flere dråber nonaqueous montering medium på smøre. Placer kanten af et dækglas på sliden, sænk det, og tryk forsigtigt for at fjerne eventuelle luftbobler. For immunokyokemi, fastsætte lufttørrede udstrygninger i 100% methanol ved stuetemperatur i 10 minutter.
Vask rutsjebanen i fem minutter i en Coplin krukke med 1X PBS gentage dette trin tre gange ved hjælp af frisk 1X PBS hver gang. Når du har fjernet objektglassene fra Coplin-krukken, skal du tørre overskydende buffer uden at røre ved smøre og tegne en linje omkring udtværingen med en vandafvisende pen. Mens du holder diaset vandret, anvende 150 mikroliter af fortyndet primært antistof opløsning på hver smøre og inkubere i en time ved stuetemperatur.
Efter inkubation vaskes objektglassene i fem minutter i en Coplin-krukke med 1X PBS, der gentager dette trin tre gange med frisk 1X PBS hver gang. Mens du holder diaset vandret, anvende 150 mikroliter af kommercielt tilgængelige hest radise peroxidase DAB visualiseringssystem til hver smøre og derefter inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask objektglassene igen tre gange i fem minutter i PBS.
Derefter kontrastain ved at nedsænke dias i en Coplin krukke, der indeholder Harris hematoxylin i 10 sekunder. Skyl af i vand fra hanen og dup med papir til at tørre grundigt. Mens du holder diaset vandret, anvende flere dråber nonaqueous montering medium på smøre.
Placer kanten af et dækglas på sliden, sænk det, og tryk forsigtigt for at fjerne eventuelle luftbobler. En god kvalitet smøre var karakteriseret ved en monolag af celler med god tæthed og bevarede morfologiske træk giver mulighed for identifikation af deres væv af oprindelse og relativ andel mellem hinanden. Desuden blev parasitter effektivt immunstained, identificerbare og tællelige.
Dårlige eller negative fine nål aspiration resultater kan skyldes for lidt materiale og dermed under repræsentativ for massen eller organet. Det kan også skyldes for meget materiale på et enkelt dias gør alt for tykke udstrygninger og forringe cytologisk evaluering. Såkaldt knust artefakt sker på grund af for meget kraft, der anvendes, når de gør udtværing forlader til forstyrrede celler resulterer i en masse nøgne kerner og DNA striber.
Når der ikke påføres tilstrækkelig kraft under udtværingspræparatet, opdeles cellerne ikke, hvilket resulterer i et lagdelt lag, der hindrer evalueringen af cellernes morfologiske egenskaber. Sammenligning af fin nåleaspiration cytopatologi med histopatologi, cytopatologi havde den fordel, bedre bevaret cellulær morfologi og bedre vurdering af relative proportioner og optælling af celler. Immunokyokemi er enklere, hurtigere og lettere at optimere end immunhistokkemi.
For fine nål aspiration, altid sikre en god immobilisering af dyret, stabilisering af organer eller masse, der skal aspirere, og en koordineret vakuum anvendelse og frigivelse. Derefter for høj kvalitet udstrygninger, straks spredes efter materialet er blevet placeret på glasset og være blid på den styrke, der anvendes til at gøre udstrygningen for at undgå celle knust artefakter. Ud over rutinemæssig mikroskopi og immunokytokemi kan dette materiale også anvendes til elektronmikroskopi, biokemisk analyse, flowcytometri, molekylærbiologi eller endda til in vitro-analyser.
Denne teknik gav os mulighed for at påvise, at fin nål aspiration kan bruges til at diagnosticere og studere sygdom hos forsøgsdyr. Vi var i stand til at diagnosticere tropisme af Trypanosoma parasitter til de eksterne mandlige kønsorganer og også at karakterisere denne sygdom i løbet af infektionen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
