Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detektion av extravaskulära Trypanosoma parasiter genom fin nål aspiration
Chapters
Summary August 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fin nål aspiration är en teknik, varvid celler erhålls från en lesion eller orgel med en tunn nål. Aspireras material smetas, färgas och undersöks under ett mikroskop för diagnos eller används för molekylär biologi, cytometri eller in vitro-analys. Det är billigt, enkelt, snabbt och orsakar minimalt trauma.
Transcript
Fin nål strävan cytologi är en billig, enkel, snabb och minimalt invasiv teknik som vi använder för att samla trypanosomer från påtagliga skador i organ i levande möss. Med tanke på att fin nål strävan är en icke-terminal förfarande, det möjliggör den upprepade provtagning i samma djur över tiden. Om dessa resultat kan översättas till nötkreatur, kommer denna metod vara mycket användbart för veterinärer att diagnostisera trypanosomiasis hos nötkreatur i en gård.
Demonstrera smutskastning förfarandet kommer att Ana Margarida Santos, en biträdande tekniker från mitt laboratorium. Till att börja bekräfta anesthetisering med tå nypa metoden. När reflexen av upprullning av benet är frånvarande, placera musen i dorsala recumbency.
Försiktigt palpera testikorna för att bestämma storlek och avstånd från överlydande huden och sedan hålla fast den mellan index och långfinger eller mellan pekfingret och tummen. För att ytterligare immobilisera målet, sträcka den överlydande huden tätt och rengör ytan med alkoholservetter. Sätt sedan in nålspetsen på en 23 gauge nål ansluten till en fem milliliter spruta i målet att se till att kolven är i resten tillstånd.
För att applicera sug, dra tillbaka sprutkolven till tre till fyra millimeters markering två till tre gånger. För att öka sannolikheten för att få ett representativt prov och att rikta mindre strukturer som epididymis, omdirigera nålen inom organet antingen i en rak linje eller längs flera olika tangenter. Släpp suget och dra sedan tillbaka nålen.
Nål kan endast avlägsnas efter att undertrycket släppts genom att släppa kolven. Annars sugs aspirera in i sprutan och är oläslig. Applicera tryck med en steril gasvävsvamp vid punktionsstället för att kontrollera eventuell blödning.
Koppla bort sprutan från nålen och fyll den med luft. Anslut nålen igen, placera nålens spets mycket nära eller till och med på objektglaset och mata försiktigt ut nålens innehåll på objektglaset. För att säkerställa replikat provtagning, utför minst en ytterligare strävan per organ och djur.
Efter att ha återgått anestesi med en subkutan injektion av 200 mikroliter på ett milligram per kilo Atipamezol i saltlösning, returnera djur till deras hem bur för återhämtning. Med hjälp av nondominant handen, plocka upp bilden som har droppen av aspirat nypa frostad ände mellan tummen och pekfingret. Med hjälp av den dominerande handen, plocka upp en ren spridare glida och placera den släta ren kant över den andra bilden precis på toppen av droppen i en vinkel på cirka 30 grader.
För att få en tunn film, glidför glidförglasan med en lätt kontinuerlig och stadig rörelse. Vila bilden och möjliggöra fullständig och snabb lufttorkning av materialet. Märk in den frostade kanten på bilden med en penna.
För Giemsa infärgning protokollet, fixera luft torkade utstryk genom att fördjupa diabilderna i en Coplin burk som innehåller 100%metanol i fem minuter. Överför sedan rutschkanorna till en Coplin burk som innehåller 20% Giemsa lösning och destillerat vatten i 30 minuter. Skölj diabilderna i kranvatten och badda med mjukpapper för att torka ordentligt.
Medan du håller bilden horisontellt, applicera flera droppar nonaqueous monteringsmedium på utstryket. Placera kanten på ett täckglas på bilden, sänk den och tryck försiktigt för att ta bort eventuella luftbubblor. För immuncytokemi, fixera lufttorkade utstryk i 100%metanol vid rumstemperatur i 10 minuter.
Tvätta bilden i fem minuter i en Coplin burk med 1X PBS upprepa detta steg tre gånger med färska 1X PBS varje gång. När du har tagit bort rutschbanorna från Coplinburken, torkar du bort överflödig buffert utan att röra smeta och dra en linje runt utstryket med en vattenavvisande penna. Medan du håller i objektglaset horisontellt, applicera 150 mikroliter av utspädd primär antikroppslösning på varje utstryk och inkubera i en timme vid rumstemperatur.
Efter inkubationen, tvätta objektglasen i fem minuter i en Coplin burk med 1X PBS upprepa detta steg tre gånger med färska 1X PBS varje gång. Medan du håller bilden horisontellt, applicera 150 mikroliter av kommersiellt tillgängliga peppar rädika peroxidas DAB visualiseringssystem till varje utstryk och sedan inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta diabilderna igen tre gånger i fem minuter i PBS.
Sedan counterstain genom att fördjupa bilderna i en Coplin burk som innehåller Harris hematoxylin i 10 sekunder. Skölj av i kranvatten och badda med papper för att torka ordentligt. Medan du håller bilden horisontellt, applicera flera droppar nonaqueous monteringsmedium på utstryket.
Placera kanten på ett täckglas på bilden, sänk den och tryck försiktigt för att ta bort eventuella luftbubblor. En god kvalitet utstryket präglades av en monolayer av celler med god densitet och bevarade morfologiska funktioner möjliggör identifiering av deras vävnad av ursprung och relativa andelen mellan varandra. Dessutom var parasiter effektivt immunostained, identifierbara och uppr ännbara.
Dålig eller negativ fin nål strävan resultat kan bero på för lite material och därmed under representativa för massan eller organet. Det kan också bero på för mycket material på en enda bild gör alltför tjocka utstryk och försämra cytologisk utvärdering. Så kallade krossade artefakt händer på grund av för mycket kraft som tillämpas när de gör utstryket lämnar till störda celler vilket resulterar i en hel del nakna kärnor och DNA-ränder.
När inte tillräckligt med kraft appliceras under utstryket beredning, celler inte disaggregera resulterar i ett stratifierat skikt som hindrar utvärdering av de morfologiska funktionerna i cellerna. Jämförelse av fina nål strävan cytopathology med histopatologi, cytopathology hade fördelen av bättre bevarade cellulära morfologi och bättre bedömning av relativa proportioner och räkna celler. Immuncytokemi är enklare, snabbare och lättare att optimera än immunohistokemi.
För fin nål strävan, alltid säkerställa en god immobilisering av djuret, stabilisering av de organ eller massa som ska aspirerade, och en samordnad vakuum ansökan och släpp. Sedan för högkvalitativa utstryk, omedelbart sprids efter det att materialet har placerats på glaset och vara skonsam mot styrkan tillämpas för att göra utstryket för att undvika cell krossade artefakter. Förutom rutinmässig mikroskopi och immuncytokemi, kan detta material också användas för elektronmikroskopi, biokemisk analys, flödescytometri, molekylärbiologi, eller till och med för in vitro-analyser.
Denna teknik tillät oss att visa att fina nål strävan kan användas för att diagnostisera och studera sjukdom i försöksdjur. Vi kunde diagnostisera tropism av Trypanosoma parasiter till de externa manliga reproduktionsorganen och även att karakterisera denna sjukdom under infektionens gång.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
