Environment
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Berigelse og påvisning af Clostridium perfringens toxinotypes i detail fødevareprøver
Chapters
Summary October 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Formålet med denne protokol er at påvise forskellige Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt indkøbte fødevarer, især Epsilon-toksin, der producerer stamme typer B og D, uden brug af anaerobe kamre.
Transcript
Vi har udviklet en nem metode til at teste fødevareprøver for de forskellige C perfringens toksinotyper. Vi er især interesseret i forekomsten af toksinotyper B og D, som producerer epsilon toksin. Vores protokol giver mulighed for nem berigelse og påvisning af de forskellige C perfringens toksinotyper uden brug af anaerobe kamre eller væksthuse med begrænset sub-dyrkning.
Denne metode kan også bruges til at teste jord, vand, fækale prøver og meget mere. Demonstration af proceduren vil være Zuha Anwar og Samantha Regan, teknikere fra laboratoriet. Begynd med at forberede modificerede hurtige perfringens medium, eller RPM.
Kombiner ingredienser i henhold til manuskript retninger, og autoklave blandingen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Tillad medium til at køle til ca 40 grader Celsius, derefter tilføje D-cycloserine til en endelig koncentration på 440 milligram per liter. Aseptisk overføre RPM til 15 milliliter koniske rør, og opbevares ved fire grader Celsius i op til en måned.
Før brug, varm mediet til 37 grader Celsius. Når der indsamles prøver, der skal testes, overføres maden til laboratoriet i henhold til manuskriptretninger. Hvis ikke test straks, kan maden opbevares på minus 20 grader Celsius.
Noter fødevaretypen og oprindelseslandet samt alle andre relevante oplysninger. For at teste maden, overføre ca en til to gram til en steril petriskål, og fint hakke det med et sterilt barberblad eller skalpel. Inokuler det i 10 milliliter PBS i et 15 milliliter konisk rør, og bland godt.
Vælg for vegetative celler ved at overføre fem milliliter PBS-fødevareblandingen til et konisk rør på 15 milliliter med 10 milliliter omdrejningstal og lukke låget tæt. Vælg for sporer ved opvarmning af de resterende fem milliliter af blandingen til 85 grader Celsius i 15 minutter. Og derefter overføre det til et rør med RPM og lukke låget stramt.
For at sikre fuldstændig blanding, vortex og invertere maden RPM kulturer. Derefter tæt forsegle koniske rør og pak lågene med paraffin film for at skabe et anaerobt miljø. Inkuber rørene natten over ved 37 grader Celsius og bemærk enhver turbiditet eller gæring den følgende morgen.
Forbered Tryptose Sulfite Cycloserine eller TSC Agar i henhold til producentens retning, og brug derefter sandwichteknikken til at vaccinere den med nattens RPM-kulturer. Forbered basislaget af pladerne ved at overføre 10 milliliter af den smeltede Agar til sterile Petrie retter og gør det muligt at størkne. Vedligehold de resterende TSC Agar ved 40 grader Celsius for det øverste lag, og overfør omhyggeligt 100 mikroliter af nattens RPM-kultur til Agar-basen.
Nogle kulturer kan være under pres på grund af gæring, så sørg for at bære alle passende personlige værnemidler. Spred inoculin med sterile glasperler eller en cellespreder, og lad omdrejningstrækket blive absorberet i Agar i fem til 10 minutter. Brug derefter en serologisk pipette til omhyggeligt at overføre 20 milliliter af den smeltede TSC Agar til pladen.
Udskift Petrie skållåget og lad TSC Agar størkne ved stuetemperatur, derefter vende skålen og inkubere det ved 37 grader Celsius natten over. Hvis det er nødvendigt, udføres serielle fortyndinger af RPM-kulturen før inokulering i TSC Agar. Efter inkubationen, undersøge plader for bakterievækst.
Aerobe bakterier kan være til stede på overfladen af Agar, mens anaerobe bakterier vil blive indlejret i Agar. Sulfit reducere bakterier vil vende de omkringliggende Agar sort, og mulige C perfringens kolonier vil være sort og indlejret i Agar. Hvis der er en tæt mængde aerob bakterievækst på pladens overflade, skal du bruge en celleskraber til at fjerne kolonier fra udvalgte områder.
Brug en steril engangs-øje dropper til at plukke de formodede C perfringens kolonier fra Agar, og sørg for at udvise luften før piercing Agar. Kolonierne overføres til 10 milliliter frisk omdrejningstal i et konisk rør på 15 milliliter. Der kan udtages prøver af flere kolonier fra samme plade til separate RPM-kulturer.
Fastgør de koniske rørlåg, pak dem ind i paraffinfilm, og inkuber dem natten over ved 37 grader Celsius. C perfringens er en BSL to organisme. Det er vigtigt at bruge passende sikkerhedsforanstaltninger til enhver tid, især når du åbner natten RPM kulturer og omhyggeligt dekontaminere og bortskaffe brugte medier.
På den næste dag, fjerne natten kulturer og undersøge dem for turbiditet og gæring, derefter gå videre med DNA-ekstraktion. Forsigtigt vende RPM kultur til at sprede eventuelle faste bakterier og forsigtigt åbne røret. Overfør en milliliter til et mikrocentrifugerør, og pellet bakterierne ved centrifugering.
Pellet med en milliliter steril PBS. Hvis ufordøjet gelatine har lagt sig oven på bakterierne, fnug det ud ved at ophidse med PBS. Forsigtigt aspirere gelatine og PBS og re-suspendere de resterende bakterielle pellet med en milliliter frisk PBS.
Det er vigtigt at fjerne enhver pelleteret gelatine med begrænset forstyrrelse af cellepellet. Manglende fjern gelatine kan hæmme DNA-ekstraktion og PCR. Centrifuge bakterierne i 10 minutter og omhyggeligt aspirere supernatant.
Derefter udføre DNA-ekstraktion ved hjælp af et kit specielt designet til gram positive bakterier. Brug DNA'et med det samme, eller opbevar det på minus 20 grader Celsius. Udfør PCR på det udtrukne DNA for at afgøre, om kulturerne er positive for C perfringens toksinotyper.
Brug C perfringens DNA som en positiv kontrol for at sikre, at alle PCR reagenser virker. Kør PCR i henhold til manuskript retninger og analysere produkterne med agarose gel elektroforese. Denne protokol blev brugt til at teste i alt 216 fødevareprøver købt fra New York detailbutikker.
Prøverne omfattede forskellige kødprøver, fjerkræprøver og skaldyrsprøver. C perfringens Type B blev anvendt som en positiv kontrol. Det blev konstateret, at 15 til 20% af de fødevarer i stikprøven test positiv for C perfringens.
Af de 34 positive prøver indeholdt 31 prøver alfa toksinet, en prøve indeholdt alfa- og beta- og epsilon toksin. Og to prøver indeholdt alfa og epsilon toksin. Vi har udviklet en nem metode til at teste fødevareprøver for de forskellige C perfringens toksinotyper.
Vi er især interesseret i forekomsten af toksinotyper B og D, som producerer epsilon toksin.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
