Login processing...

JoVE Journal
Genetics

This content is Open Access.

JoVE Journal Genetics

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Journal (Genetics)

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Journal (Genetics)

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Click here for the English version

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

Article DOI: 10.3791/60130-v

September 1st, 2019 •

Chi-Keung Cheng¹, Terry H.Y. Wong¹, Yuk-Lin Yung¹, Nelson C.N. Chan¹, Margaret H.L. Ng^1,2

¹Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, ²State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 1st, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Direktleverans av förmonterade Cas9/guide RNA ribonukleoprotein komplex är ett snabbt och effektivt sätt för genomredigering i hematopoietiska celler. Här använder vi denna metod för att ta bort en RUNX1 intronic ljuddämpare och undersöka transkriptionella svaren i OCI-AML3 leukemi celler.

Transcript

Cis-reglerande element som initiativtagare och förstärkare är viktiga bestämningsfaktorer för genuttryck. Traditionella metoder för att studera dessa element är mödosamma och innebär ofta användning av heterologa reportergener. Här visar vi användningen av CRISPR för att undersöka transkriptionella roll en RUNX1 intronic ljuddämpare i leukemi cellinje.

Protokollet är enkelt att utföra och tillåter snabba bedömningar av genreglerande funktioner i det endogena gensammanhanget. Hematopoetiska celler är ofta svåra att transfekt med en plasmid baserade metoder. I detta protokoll använder vi elektroporationen för att leverera förmonterade Cas9, guide RNA, komplex in i cellerna.

Fördelarna med detta tillvägagångssätt inkluderar användning av förbättrad redigering effektivitet och cellens bärkraft samt minskade off-target effekter. Även den efterföljande användningen av fragmentanalys möjliggör enkel och snabb screening av de önskade mutantklon från en stor mängd prover. Demonstrerar proceduren blir Yuk-Lin Yung, tekniker för mitt laboratorium.

Börja med att designa två CRISPR RNAs, en femprime och de andra tre främsta av mål cis-reglerande element, eller CRE. Se till att en PAM av NGG ligger omedelbart nedströms av målsekvensen för Cas9-igenkänning. För att bilda gRNA-komplexet, kombinera CRISPR RNA och spår-RNA i TE-buffert enligt manuskriptriktningar, för en slutlig duplexkoncentration på 44 mikromolar.

Inkubera blandningen vid 95 grader celsius i fem minuter och låt den svalna till rumstemperatur. Späd den rekombinanta Cas9-nukleasen med PBS för en slutlig nukleaskoncentration på 36 mikromolar. Blanda sedan en lika stor volym av den utspädda nukleasen med var och en av gRNA-duplexerna och inkubera dem i 20 minuter vid rumstemperatur så att RNP-komplexet kan bildas.

Centrifugera 2,5 miljoner celler i ett 1,5 milliliter rör vid 500 gånger g i fem minuter. Sedan kassera supernatant och åter upphäva cellerna i 163 mikroliter av RPMI 1640 medium utan fenolröd. Tillsätt 16,7 mikroliter av RNP-komplexet och 3,6 mikroliter av 100 mikromolarelektroporationsförstärkare till cellerna och överför blandningen till en 0,2 centimeters gapelektroporationsv cuvette, var noga med att inte introducera några bubblor.

Elektroporat cellerna och överföra dem till en T-25 vävnadsodlingskolv som innehåller 6 milliliter komplett RPMI 1640 medium. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid. En dag efter elektroporation, späd cellerna till 5000 celler per milliliter i komplett RPMI 1640 medium.

Och tillsätt 100 mikroliter av cellen suspension i varje brunn av en 96-väl vävnad kultur tallrik. Odla cellerna i sju till 14 dagar och extrahera sedan genomiskt DNA med hjälp av ett reningssystem med hög genomströmning. Tillsätt 100 mikroliter av plåtbindning och lysbuffert till varje brunn av en 96-välde extraktionsplatta, följt av 50, 000 celler åter upphängda i 10 mikroliter av PBS.

Blanda brunnsinnehållet genom att pipettera upp och ner. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter för att låta det genomiska DNA:t binda till brunnarna. Sedan försiktigt aspirera lösningen från brunnarna och tvätta dem med 120 mikroliter av tvättbuffert.

Lufttorka plattan. Lägg till 20 mikroliter av PCR mix till varje brunn och kör PCR enligt manuskriptet riktningar. När förstärkningen är klar, uppskatta produktens mängd genom att mäta koncentrationen av ett utvalt antal prover med en fluorometer.

Späd alla prover till 0,5 nanogram per mikroliter med nukleasfritt vatten. Blanda en mikroliter av den utspädda PCR-produkten med 8,5 mikroliter av avjoniserad formamid och 0,5 mikroliter av fluorescerande färgämnesmärkta storleksstandard i en 96-brunns plat kompatibel med den genetiska analysatorn. Täck plattan med en plattsepa och denaturera proverna i 95 grader Celsius i tre minuter i en termocyklare.

Utför kapillärelektrofores för att separera de märkta PCR-produkterna och analysera resultaten på analysprogramvaran. Kontrollera den orange ikonen för att visa de märkta fragmenten och storleksstandarden för att bedöma kvaliteten på storleksanrop. Kontrollera sedan den blå ikonen för att visa de märkta PCR-produkterna.

Identifiera de toppar som motsvarar produkter av vildtyp och mutantprodukter och uppskatta mutantnivån i varje prov genom att dela upp området under mutanttoppen med summan av området under wild-type och mutanttopparna. Markera flera cellpooler med höga nivåer av de förväntade borttagningarna för ytterligare serieutspädningar. Upprepa DNA-extraktionen, fluorescerande PCR- och kapillärelektroforesstegen och välj kloner med mutantnivåer som är större än 95 %för efterföljande analys.

Extrahera totalt RNA från de utvalda klonerna och utför gratis DNA-syntes. Blanda RNA med en poly-T primer och dNTPs enligt manuskriptriktningar och inkubera vid 65 grader Celsius i fem minuter. Placera sedan reaktionen på is i minst en minut.

Lägg till tio mikroliter av cDNA syntes mix till reaktionen. Sedan inkubera provet vid 50 grader Celsius i 50 minuter och 85 grader Celsius i fem minuter i en termocyklare. Efter cDNA-syntesen behandlar du proverna med en mikroliter av RNase H och inkuberar dem i 37 grader Celsius i 20 minuter.

Designprimrar och TaqMan-sonder speciellt för individuell avskriftsvarians som genereras från alternativa initiativtagare och klona DNA-fragmenten som innehåller de specifika avskriftssekvenserna till plasmid-DNA. Gör en tiofaldig utspädningsserie av de rekombinanta plasmiderna som standardkurvor för transkriptionskvantifiering. Förbered 20 mikroliter av PCR mix för varje prov och kör realtid PCR enligt manuskriptet riktningar.

Analysera resultaten och normalisera kopians nummer av målavskrifterna i varje prov med en hushållningsgen. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att radera RUNX1 intronic ljuddämpare och borttagningen bekräftades med kapillär gel elektrofores. De förväntade storlekarna på de vilda pcr-produkterna och mutanta PCR-produkter är ca 500 baspar respektive 230 baspar.

Storleken på de muterade produkterna kan variera mellan klonerna på grund av indels bildas vid klyvning platser. Sanger sekvensering användes för att bekräfta identiteten på borttagningarna. RUNX1-genen innehåller två initiativtagare, P1 och P2 som producerade tre stora mRNA-avskrifter:RUNX1c av P1, och RUNX1a och RUNX1b av P2. Realtid kvantitativa PCR kan användas för att avgöra hur borttagningen av ljuddämpare elementet påverkar uttryck för dessa avskrifter.

En bra design av CRISPR RNAs är viktigt för dess bedömning av experimentet. Se till att CRSIPR-RNA är förpackat nära den avsedda borttagningsregionen. Säkerställ också än en PAM-sekvens ligger nedströms av målsekvensen för Cas9-igenkänning.

Förutom att studera CRE kan denna strategi användas för genplatsstudier och fungerar som ett alternativ till RNA-interferens för att undersöka genfunktioner. Genom att kombinera med kromosom konformation capture tekniker CRISPR kommer säkert att hjälpa dechiffrera medverkan av CREs i den förändrade genomet organisation och genuttryck kopplade till olika hälsoproblem som cancer.

X

Simple Hit Counter