Neuroscience
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Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval
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Summary April 23rd, 2020
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Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.
Transcript
Cette procédure décrit la collection de régions discrètes du cerveau congelé pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles. Étant donné que les régions du cerveau sont empêchées de récolter par dissection, les molécules cibles sont préservées et le chercheur a le temps de disséquer et de stocker soigneusement les régions d’intérêt. Il peut d’abord être difficile d’identifier les régions d’intérêt.
L’utilisation de repères cérébraux communs au fur et à mesure qu’ils émergent et reculent à travers les sections par rapport aux régions désirées permettra d’identifier clairement. Après avoir enlevé le cerveau des souris adultes euthanasiées de type CD-1, congelez le tissu pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane. Pré-réfrigérer avec de la glace sèche et la conserver à moins 80 degrés Celsius.
24 heures avant de disséquer le tissu, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de paquets de congélateur décongelés. Et sandwich les côtés de la matrice entre deux paquets de congélateur en s’assurant de laisser environ un demi-centimètre entre le fond des fentes de rasoir et le haut des paquets. Installez une plaque de verre congelée pour la dissection en remplissant une boîte isolée de glace jusqu’à environ cinq centimètres du haut.
Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 centimètres sur le dessus. Et couvrez-le de bâches en plastique noir. Placer une plaque de verre sur le dessus du plastique.
Et de la glace sèche autour des bordures de la plaque. Retirez la matrice cérébrale gelée du congélateur et insérez le cerveau, côté cortex vers le haut, dans la matrice. Laisser le tissu équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 minutes.
Garder le couvercle ouvert pendant ce temps. Utilisez des forceps froids pour ajuster la position du cerveau dans la matrice de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc. Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et pressez-la d’environ un millimètre dans le tissu.
Ensuite, placez une lame réfrigérée à chaque extrémité du cerveau et appuyez jusqu’à la matrice. Commencez ensuite à ajouter des lames réfrigérées à l’extrémité rostrale, en les plaçant dans les fentes une à la fois et en les appuyant doucement un millimètre dans le tissu. Continuer à ajouter des lames à intervalles d’un millimètre, en travaillant vers l’extrémité caudale.
Lorsque toutes les lames sont en place, appuyez sur le dessus avec les doigts, la paume ou un objet contondant et secouez-les lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu. Une fois que les lames ont atteint le bas des fentes, saisir chaque côté du groupe de lames et les libérer de la matrice en se berçant dans les deux sens. Après avoir libéré le groupe de lames placez-les côté rostral vers le haut sur la plaque de verre, et mettez la glace sèche à côté ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.
Ensuite, placez la pile avec des bords tranchants vers le bas et séparez les lames en déplaçant la pile entre le pouce et les doigts. Alignez la section sur les plaques de verre de rostral à caudale et séparez le tissu des lames en les fléchissant entre les doigts, ou en les séparant d’une deuxième lame réfrigérée. Parfois, le tissu peut coller des deux côtés d’une lame et le soin doit être pris pour maintenir l’orientation rostrale à caudale.
Avant de commencer la dissection, ouvrez l’Atlas du cerveau de la souris Allen ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Utilisez des forceps ou des lames réfrigérés pour retourner la section. Et assurez-vous que la région d’intérêt est cohérente dans toute la section.
Couper dans la section avec un scalpel propre ou un poinçon, poussant le métal doucement mais fermement dans le tissu. Le balancer d’avant en arrière pour faire la coupe. Après avoir récolté la région d’intérêt, placez-la dans des tubes pré-réfrigérés de 1,5 millimètre étiquetés et rangez-les à moins 80 degrés Celsius.
Pour traiter le tissu, ajoutez un tampon RIPA froid pour l’extraction des protéines ou un guanidinium contenant du solvant pour l’extraction de l’ARN et homogénéisez-le immédiatement avec un dus au verre ou un homogénéisateur mécanique. Pour valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles adultes de type SAUVAGE CD-1, et l’ARN et les protéines ont été caractérisés. Lorsqu’il est analysé avec l’électrophoresis capillaire, l’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomales 28S et 18S, aussi bien qu’un frottis entre 25 et 200 nucléotides.
Tandis que l’ARN de haute qualité montre les bandes ribosomales distinctes peu ou pas de signal dans la région inférieure de poids moléculaire. L’ARN obtenu à l’aide de la méthode de dissection congelée a été comparé à l’ARN préparé à partir de tissus fraîchement récoltés. Les deux méthodes produisent de l’ARN avec un nombre élevé d’intégrité et un baguage ribosomal fort.
Pour confirmer que cette méthode peut être employée pour préserver le microenvironnement du tissu disséqué pour l’analyse plus tard, l’ARN a été extrait du cortex préfrontal médial disséqué qui avait été stocké pendant plusieurs semaines. Tous les échantillons ont produit l’ARN de haute qualité avec le baguage ribosomal distinct et les nombres d’intégrité d’ARN au-dessus de huit. Pour confirmer l’intégrité protéique des échantillons disséqués congelés, la protéine a été recueillie, transférée à la nitrocellulose et à la sonde avec anticorps contre la cible de poids moléculaire élevé KCC2, et l’actine de protéine de poids moléculaire inférieur.
Dans tous les cas, les bandes étaient nettes et distinctes, sans produits de décomposition discernables. Il est important de garder les tissus congelés tout au long du processus car cela préserve le microenvironnement des sections et de maintenir la morphologie de la section pour la comparaison avec les images de l’atlas du cerveau. Les régions d’intérêt recueillies de cette manière peuvent être stockées pendant plusieurs mois à un taux négatif de 80 degrés Celsius et peuvent être utilisées dans de nombreuses applications en aval, y compris rt-qPCR, ARN-Seq, analyse des taches occidentales, et HPLC.
Cette méthode a été utilisée pour explorer les changements moléculaires dans les systèmes limbiques des rongeurs périnatals exposés au THC et à d’autres cannabinoïdes afin de mieux comprendre comment ces médicaments peuvent affecter le développement du cerveau.
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