Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению
Chapters
Summary April 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и общедоступных инструментов.
Transcript
Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и широко доступных инструментов. Поскольку области мозга заморожены от сбора урожая путем вскрытия, молекулы-мишени сохраняются, и исследователь у него есть время тщательно вскрыть и хранить области, представляющие интерес. Определение регионов, представляющих интерес, на начальном этапе может быть сложной задачей.
Использование общих ориентиров мозга, как они возникают и отступают через разделы по отношению к желаемым регионам сделает идентификацию ясно. После удаления мозгов из усыпанных взрослых мышей CD-1 дикого типа, вспышка заморозить ткани в течение 60 секунд либо жидкого азота или изопентана. Предварительно охладить с сухим льдом и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
За 24 часа до вскрытия ткани поместите чистую матрицу мозга на стопку разморожевания морозильных пакетов. И сэндвич стороны матрицы между двумя морозильными пакетами убедившись, что оставить примерно пол-сантиметра между нижней части бритвы слотов и верхней части пакетов. Установите замороженную стеклянную пластину для вскрытия, заполнив изолированную коробку со льдом до пяти сантиметров сверху.
Затем поместите 2,5-сантиметровый слой сухого льда сверху. И накройте его черной пластиковой пленкой. Поместите стеклянную тарелку поверх пластика.
И сухой лед вокруг границ плиты. Удалите замороженную матрицу мозга из морозильной камеры и вставьте мозг, кору вверх, в матрицу. Дайте ткани уравночные до температуры в коробке в течение 10 минут.
Сохраняя крышку открытой в течение этого времени. Используйте холодные типсы, чтобы настроить положение мозга в матрице так, чтобы сагиттаальный пазуха и поперечная пазуха выстраивались в линию перпендикулярных канавок блока. Как только мозг находится в положении, поместите охлажденное лезвие бритвы рядом с его центром и нажмите его примерно на один миллиметр в ткань.
Затем поместите одно охлажденное лезвие на каждом конце мозга и нажмите всю дорогу вниз в матрицу. Затем начните добавлять охлажденные лезвия на ростральном конце, помещая их в слоты по одному и осторожно прижимая их на один миллиметр в ткань. Продолжайте добавлять лезвия с интервалом в один миллиметр, работая в направлении хвостового конца.
Когда все лезвия на месте, нажмите сверху пальцами, ладонью или тупым предметом и качайте их медленно из стороны в сторону, чтобы переместить их через ткань. После того, как лезвия достигли нижней части слотов, схватить каждую сторону группы лезвий и освободить их от матрицы, качаясь вперед и назад. После освобождения группы лезвий поместите их ростральной стороной вверх на стеклянную пластину, и положить сухой лед рядом с или на вершине стека для дальнейшего замораживания образцов для облегчения разделения.
Затем поместите стек с острыми краями вниз и отделить лезвия, перемещая стек между большим и большим пальцами. Выстроить раздел на стеклянных пластинах от рострала до каудала и отделить ткань от лезвий, сгибая их между пальцами, или отделяя их вторым охлажденным лезвием. Временами, ткань может придерживаться обеих сторон лезвия и должны быть приняты меры по поддержанию ростральной каудальной ориентации.
Перед началом вскрытия откройте атлас мозга Аллена Мауса или другую ссылку и найдите ориентиры, необходимые для определения регионов, представляющих интерес. Используйте охлажденные типсы или лезвия, чтобы перевернуть раздел. И убедитесь, что регион интересов является последовательным во всем разделе.
Нарезать секцию чистым скальпелем или пуншом, аккуратно, но твердо в ткань. Rocking его вперед и назад, чтобы сделать разрез. После уборки области интереса, поместите его в помечены предварительно охлажденных 1,5 миллиметра труб и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для обработки ткани добавьте холодный буфер RIPA для извлечения белка или гуанидин, содержащий растворитель для экстракции РНК, и немедленно гомогенизируйте его стеклянными падениями или механическим гомогенизатором. Для проверки этого метода, медиальной префронтальной коры был собран из взрослых CD-1 диких мышей типа мужчин, и РНК и белок были охарактеризованы. При анализе с капиллярным электрофорезом, деградированная РНК показывает потерю интенсивности 28S и 18S рибосомных полос, а также мазок между 25 и 200 нуклеотидов.
В то время как высококачественная РНК показывает различные рибосомные полосы практически без сигнала в области более низкого молекулярного веса. РНК, получаемая с использованием замороженного метода вскрытия, сравнивалась с РНК, подготовленной из свежесобранной ткани. Оба метода производят РНК с высокими номерами целостности и сильной рибосомной полосой.
Чтобы подтвердить, что этот метод может быть использован для сохранения микроокниронности вскрытой ткани для более поздних анализов, РНК была извлечена из вскрытой медиальной префронтальной коры, которая хранилась в течение нескольких недель. Все образцы производили высококачественную РНК с различными рибосомной полосой и номерами целостности РНК выше восьми. Для подтверждения целостности белка замороженных вскрытых образцов, белок был собран, передан в нитроцеллюлозы и зонд с антителами против высокой молекулярной цели веса KCC2, и более низкий молекулярный вес белка актина.
Во всех случаях полосы были острыми и отчетливыми без заметных продуктов разбивки. Важно, чтобы ткани заморожены на протяжении всего процесса, поскольку это сохраняет микроокнижение секций и поддерживать морфологию раздела для сравнения с изображениями атласа мозга. Области интересов, собранные таким образом, могут храниться в течение нескольких месяцев при отрицательном 80 градусов по Цельсию и могут быть использованы во многих приложениях ниже по течению, включая RT-qPCR, РНК-Сек, западный анализ помарки и HPLC.
Этот метод был использован для изучения молекулярных изменений в лимбических системах перинатальных грызунов, подвергшихся воздействию ТГК и других каннабиноидов, чтобы лучше понять, как эти препараты могут повлиять на развитие мозга.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
