Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet

Ved hjælp af protokollen som en biofysisk effekt af forskellige optogenetiske aktuatorer på kardiomyocyt aktivitet kan testes for at støtte i udviklingen af optogenetiske eksperimenter i hjertevæv og hele hjerter. Ved at kombinere patch clamp teknik med sarcomere tracking og kulfiber assisteret kraft målinger, kan vi studere virkningerne af GtACR1 fotoaktivering på el og mekanik af ventrikulære kardiomyocytter. Optogenetisk hæmning kan potentielt anvendes til optisk defibrillering.

GtACR1 er et optogenetisk værktøj, der muliggør lyddæmpning af hjerteaktivitet. Denne teknik er fuldt ud anvendelig til andre forskningsområder såsom glat og encellede muskel celle undersøgelser. Selv om denne protokol ikke kan bruges til høj gennemløb screening, det giver et middel til omfattende analyse af cardiomyocyte elektrisk og mekanisk funktion.

Så som man siger, et billede siger mere end tusind ord. Hvor meget mere information kan vi komme over i video? Nogle af vores værktøjer og teknikker, der er involveret i enkelt myocyte stretching og i sonde forberedelse er meget indviklet, og det er meget lettere at formidle dem i en video i forhold til en beskrivelse.

Efter blodet er blevet vasket ud af saltvand perfundaerede hjerte fra en ni til 10-uger gamle New Zealand hvid kanin, skifte perfusate til en lav-calcium, høj-kalium opløsning og perfem hjertet i yderligere to minutter efter hjertet holder op med at slå. Se enzymopløsningen, start recirkulere enzymopløsningen tilbage i reservoiret efter to minutters fordøjelse, og sæn neder hastigheden til 16 milliliter i minuttet efter fem minutters fordøjelse. Når vævet ser blødt ud efter 40-50 minutters fordøjelse, skær hjertet af kanylen og anse straks hjertet i blokerende opløsning.

Tilsæt blokerende opløsning, indtil vævet er fuldt dækket. Skær højre hjertekammer og septum og adskille venstre hjertekammer. Fjern papillære muskler og bruge fine kraftbefæstelse og en pipette til forsigtigt at trække fra hinanden vævet til at frigive cellerne ved mekanisk dissociation.

Cellesuspensionen filtreres gennem en maske med en millimeter kvadrerede porer, og cellerne filtreres ved centrifugering. Derefter resuspend den cardiomyocyte pellet i frisk blokerende opløsning. For en patch clamp eksperiment, pels autoklaveret coverslips i en petriskål med 100 mikrogram pr. milliliter laminin umiddelbart før cellekultur.

Til kulfibereksperiment, pels petriskåle med 0,12 gram pr. milliliter Poly-HEMA i en 95-til-fem ethanol-til-vand opløsning. Ti til 15 minutter efter resuspending af kardiomyocytter, fjerne supernatant og resuspend cellerne i kultur medium. Efter optælling, frø cellerne på en dækslæb i en petriskål på et mål tæthed på 1,75 gange 10 til de fire celler pr milliliter.

Inkuber kulturerne i tre til fire timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Ved inkubationens afslutning erstattes mediet fra dæksletkulturer med frisk medium indeholdende adenovirustype fem kodning for GtACR1-eGFP ved en mangfoldighed af infektion på 75. Vend kulturerne tilbage til vækstvøsen i 48 timer.

For at udføre en patch clamp eksperiment, skal du bruge en mikropipette puller til at trække 1,7 til 2,5 megaohm patch pipetter fra soda lime glas kapillærer og initialisere dataindsamling software. Placer en dækslæd med celler i målekammeret, der indeholder ekstern opløsning, og vælg kardiomyocytten baseret på dens eGFP fluorescens. Dernæst fylde en patch pipette med intern opløsning og fastgør pipetten til pipetteholderen, der indsætter sølvchloridlakeret sølvoptagelsestråd i den interne opløsning.

Membrantesten skal anvendes til at anvende 10 millivoltimpulser i 15 millisekunder med en baseline på nul millivolt. Når du har nået den celledemul er tilknyttet, skal du skifte til helcelletilstand med et holdepotentiale på minus 60 millivolt i dataindsættelsessoftwaren. Derefter forsigtigt anvende undertryk for at få adgang til hele celle konfigurationen ved at briste membranen.

En vellykket brud vil blive dokumenteret ved en øjeblikkelig stigning i den målte kapacitans. Optag fotoaktivationsprotokoller i spændingsklemmertilstand ved minus 74 millivolt med lysimpulser på 300 millisekunder eller handlingspotentialer i den aktuelle klemmetilstand ved nul picoampere. For at producere kulfiber, først montere pipetten på pipette holdere af puller.

Træk glaskapillærerne i to pipetter med en samlet tilspidset længde på ca. 11 millimeter og en endelig indre diameter på ca. 30 mikrometer. Brug derefter et stereomikroskop til at justere en kapillær i orienteringscirklen og bøj det med op til 45 grader ved at trykke ned på spidsen af kapillæren med en bender. Varm glødetråden op, indtil kapillæren opretholder 45 graders vinkel, selv efter at benderen er fjernet.

Efter bøjning kapillær, bruge fine kraftærgninger udstyret med bløde slanger til at tage en kulfiber ud af røret og passer det ind i den fine spids af kapillær. Skub fiberen i kapillæren op til svinget. Skær kulfibre, så de projicere to milliliter fra spidsen af kapillær og bruge cyanoacrylat lim til at fastsætte fibrene til den forreste del af hver kapillær.

For at kalibrere fibrene fastgøres en kapillær til en holder, der styres af en mikromanipulator og en piezomotor. Flyt kapillæren mod sensoren, og juster den i forhold til sensoren. Sæt fiberspidsen i kontakt med kraftsensoren uden at frembringe nogen kraft.

Den samlede bevægelse af piezomotoren er 60 mikrometer. Flyt piezomotoren i seks 10 mikrometertrin mod kraftsensoren. Sensoren har en følsomhed på 0,05 millinewtons pr volt og en kraftområde på nul til 0,5 millinewtons.

Læs den målte spænding for hvert trin og fjern kulfiberen fra sensoren. For at registrere styrken af ordregivende kardiomyocytter, pels overfladen af et dækglas med Poly-HEMA og placere den i målekammeret. Fyld kammeret med ekstern bad løsning.

Fastgør både kulfiberbelastede kapillærer til scenen mikromanipulator og justere dem i en vinkel, således at kulfibrene er nær vandret til overfladen af målekammeret. For at kontrollere, om fibrene er korrekt justeret, fokusere på overfladen af målekammeret, sænke den første fiber, og flytte fiber vandret. Spidsen af fiberen skal glide på overfladen af målekammeret.

Følg den samme procedure for den anden fiber. Når lyset er slukket, tilsættes et par dråber kultiveret celleaffjedring til kammeret og anvende korte grønne lysimpulser for at vælge celler, der kontrakt som reaktion på det grønne lys stimulation. For at fastgøre den første fiber, forsigtigt komprimere cellen ved at sænke fiberen derefter frigive trykket.

Fastgør den anden fiber parallelt med den første i den anden ende af kardiomyocyt for at have et maksimalt antal sarcomeres mellem de to fibre. Når begge fibre er fastgjort, løft fibrene, så cellen ikke længere er i kontakt med kammeroverfladen. Bring sarcomeres i fokus, indstille sarcomere længde tracking vindue mellem fibrene, og bruge kanten detektionsmodulet til at spore fiber bøjning.

Indstil detektionsområderne med de røde og grønne vinduer, og definer en tærskel ved det første derivat af lysintensitetssporingen. Optisk tempo cellen, mens sporing sarcomere længde og fiber bøjning. I dette tilfælde, vi tempo på 0,25 hertz.

Efter optagelse af mindst 15 optisk fremkaldte sammentrækninger, felt stimulere cellen elektrisk. Find tærsklen for at fremkalde sammentrækninger og anvende 1,5 gange tærsklen spænding for elektrisk pacing. For en hæmning protokol, anvende elektriske stimuli til fremkalde sammentrækninger og derefter udsætte cellen til en vedvarende lys puls på forskellige lysintensiteter.

Optag mindst 15 sammentrækninger efter lys-induceret hæmning. GtACR1 udtrykkes i kultiverede kaninkardiomyocytter. GtACR1 fotoaktivering ved en lysintensitet på fire milliwatt pr. millimeter kvadreret i 300 millisekunder resulterer i store indadgående strømme på minus 74 millivolt med en målt topstrøm på 245 picoampere.

I dette repræsentative eksperiment blev handlingspotentialer udløst enten elektrisk med strømindsprøjtninger 1,5 gange tærsklen eller optisk med 10 millisekundlyselyrimpulser. Optisk tempo kardiomyocytter viste en langsommere handling potentiale debut. Elektrisk udløste handlingspotentialer blev hæmmet under vedvarende lys.

Højere strøminjektninger og 1,5 gange tærsklen under den vedvarende lysapplikation fremkalder heller ikke handlingspotentialer. Den cardiomyocyte genereret en sammentrækning kraft på 232 mikronewtons per millimeter kvadreret på elektrisk pacing og 261 mikronewtons per millimeter kvadreret efter optisk pacing. Langvarig grønt lys pulser hæmmet sammentrækninger med post-hæmning tilbagevendende sammentrækninger genererer en lavere kontraktile kraft i overensstemmelse med diastolisk calcium tab fra kanin kardiomyocytter.

Vi anbefaler at øve teknikkerne, før du udfører et eksperiment, især da positionering af mikrosonder i mørke kan være udfordrende. er meget vigtigt, når man analyserer kardiomyocyt kontraktilitet, da det kan påvirke kraft produktion og afslapning. Forskellige efterloads kan også anvendes til isotonic og auxotonic sammentrækning analyse.

Disse teknikker gør det muligt at karakterisering af de biofysiske virkninger af aktivering af nyudviklede optogenetiske aktuatorer i kardiomyocytter, hvilket er afgørende for at vælge det bedst egnede optogenetiske værktøj til hvert eksperiment. Vær opmærksom på, at adenovirustransuktion og alle trin efter transduktionen skal udføres under biosikkerhedsniveau II-betingelser.