Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Separasjon av cellekonvolutten for gram-negative bakterier i indre og ytre membranfraksjoner med tekniske justeringer for acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Gram-negative bakterier produserer to romlig segregerte membraner. Den ytre membranen er partisjonert fra den indre membranen av en periplasme og et peptidoglykansk lag. Evnen til å isolere de to bilagene av disse mikrobene har vært avgjørende for å forstå deres fysiologi og patogenese.
Transcript
Studere hvordan mikrober regulerer den kjemiske sammensetningen av de enkelte bilayers vil informere vår kunnskap om mekanismer for antibiotikadrap, antimikrobiell resistens og sykdomspatogenese. Denne teknikken partisjonerer cellekonvolutten av gram-negative bakterier i to definerte fraksjoner uten å bruke vaskemiddel. Derfor kan lipider, proteiner og sukker vurderes i et miljø som er semi-innfødt.
Noen av trinnene er tidsavhengige og krever fokus og koordinering. Bruk i utgangspunktet ett eller to prøver. Når komfortnivået øker, kan flere prøver legges til.
Ikke mer enn seks prøver skal håndteres samtidig. Dette er en flerdagsprosedyre, og visuelle kontrollpunkter er nyttige for å vurdere effekt og feil. Før du utfører dette noen ganger siste trinn.
Strek bakteriene fra frosne glyserollagre på friske agarplater. Når koloniene utvikler seg, lagre platene på fire grader Celsius. Bruk en enkelt koloni til å inokulere et fem milliliter rør fylt med kjøttkraftmedia og kultur bakteriene etter ønske over natten.
Tilbake fortynne natten bakteriell kultur i en liter av de foretrukne kjøttkraft media og inkubere flasker. Når ønsket optisk tetthet er oppnådd, fjern kolben fra inkubatoren og legg dem på is. Mål den optiske tettheten av kulturen på 600 nanometer og beregn volumet av kultur som tilsvarer mellom seks og åtte ganger 10 til ellevte bakterielle kolonidanneenheter.
Legg dette volumet av kultur til et sentrifugerør og sørg for at de gjenværende kulturene forblir på is til de skal brukes. Pellet bakteriene ved sentrifugering i 10 minutter i en fast vinkel, høyhastighets sentrifuge på 7, 000 til 10, 000 ganger G og fire grader Celsius. Dekanter forsiktig overnatanten og kast den.
Resuspend hver celle pellet i 12,5 milliliter buffer A.Legg til en magnetisk rørestang til cellefjæringen. Tilsett 180 mikroliter på 10 milligram per milliliter lysozym til hver celleuspensjon. Etter å ha samlet lysozymet EDTA behandlet bakterier ved sentrifugering, legg raskt proteasehemmeren, magnesiumklorid og kjerner til bakteriene og raskt gjenbruke cellene i buffer B.Rør i to minutter, holde suspensjonene på is.
Deretter legger du til 12,5 milliliter edta-oppløsning på 1,5 millimolar til hver celleretur og fortsetter å røre på isen i ytterligere syv minutter. Dekanter suspensjonene i 15 milliliter koniske rør. Sentrifuger suspensjonene ved 9.000 til 11.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Kast supernativa i en biohazard avfallsbeholder og behold pellets på is. Legg til 25 milliliter buffer B i hver cellepellet. Deretter legger du til 55 mikroliter av en molar magnesiumklorid, en mikroliter rnase / dnase / nuklease reagens og en mikroliter proteasehemmercocktail.
Resuspend pellets i blandingen. Kraftig pipette og virvel til løsningene vises homogene. Oppbevar suspensjonene på isen.
Hell prøven i homogenisatorprøvesylinderen og bring cellen til 20.000 PSI. For å unngå aerosolisering av patogener, tilstand det trykksatt apparatet i buffer B og justere trykknivåene før du legger bakteriell suspensjon. Engasjer trykkcellen og hent 10 milliliter buffer B som en forholdsregel.
Samle cellen lysate i 50 milliliter koniske rør på is samtidig som prøvene på is. For å oppnå fullstendig lysis, gjenta denne prosessen tre til fem ganger. For å pellet de resterende, intakte, cellemateriale, sentrifugere lysed bakterielle prøver på 6, 169 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter.
Fordel supernativa som nå inneholder homogeniserte membraner, i polykarbonatflasker for ultracentrifugation. Ultracentrifuge cellen lysates på 184, 500 ganger G og fire grader Celsius i minst en time. Kast supernativa og behold membranpellets på is.
Ved hjelp av et glass, Dounce homogenizer, resuspend membranen pellets i en milliliter av lav tetthet isopyklin sukrose gradient løsning. Deretter bruker du et glass, Pasteur pipette for å overføre prøven homogenat til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og plassere røret på is. For å forberede sukrosegradienten, hold et polypropylen eller Ultra-klart Open-Top-rør i en litt vippet posisjon.
Tilsett sakte to milliliter av den høyere tetthetssukroseløsningen. Deretter legger du til fire milliliter av den lavere tetthetssukroseløsningen. Når du forbereder tetthetsgradienten, legg til sukroseløsningen sakte for å unngå å blande lagene.
Sukroselagene skal være litt synlige og vises generelt definert. Deretter legger du til den totale membranfraksjonen som tidligere ble brukt på en milliliter lav tetthet, isopyklinisk sukroseløsning. Til slutt fyller du resten av røret ved å legge til omtrent seks milliliter av lav tetthet, isopyklinisk sukrosegradientløsning.
Ultracentrifuge prøvene ved hjelp av en svingende bøtte rotor på 288, 000 ganger G og fire grader Celsius i 16 til 23 timer. Klipp enden av en P1000 pipettespiss omtrent fem milliliter fra punktet. Etter at sentrifugeringen er fullført, bruk pipetten til å fjerne det øvre, brune laget fra røret.
Overfør dette laget, som inneholder den indre membranfraksjonen, til en polykarbonatflaske for ultracentrifugation. La omtrent to milliliter av sukroseløsningen over grensesnittet mellom 53% sukrose og 73% sukrose for å sikre at den nedre, hvite, ytre membranfraksjonen ikke krysser forurenser den indre membranfraksjonen. Igjen ved hjelp av en P1000 pipettespiss med enden fjernet, fjern det ytre membranlaget og overfør det til en polykarbonatflaske.
Fyll det gjenværende tomrommet av polykarbonatflaske med isolert membranlagringsbuffer og bland ved inversjon eller pippetting. Behold prøvene på is. For å samle membranene, ultracentrifuge polykarbonatflaskene ved 184, 500 ganger G og fire grader Celsius i en time.
Til slutt kast supernativa og tilsett 500 til 1000 mikroliter lagringsbuffer. Resuspend membranene ved Dounce homogenisering. Samle prøvene i to milliliter mikrocentrifuge rør.
Totale membranpellets ble skrapt, Dounce homogenisert og ultracentrifuged over sukrose tetthet gradienter for å skille de indre og ytre membraner. En sukrose tetthet gradient på 20%53%73%var tilstrekkelig for partisjonering noen bakterielle stammer. Men ikke for partisjonering A.baumannii som ble partisjonert ved hjelp av en 20%45%73%gradient.
For å vurdere effektiviteten av separasjonen ble membranprøver testet for NADH dehydrogenase, et enzym som ligger i bakteriens indre membran. En reduksjon i optisk tetthet ved 340 nanometer indikerte tilstedeværelsen av enzymet. Optisk tetthet ble målt for 50 mikrogramprøver av indre og ytre membranfraksjoner fra vill type S.typhimurium, E.coli K12 DH5a og galE mutant S.typhimurium.
En høyere konsentrasjon av protein ble tilsatt ved analyse av renheten av A.baumannii membranfraksjoner fordi en innledende analyse ved hjelp av 50 mikrogram antydet at de relative nivåene av NADH dehydrogenase var lavere for A.baumannii enn for de andre bakteriestammene. For å vurdere krysskontaminering av de indre membranfraksjonene med ytre membranfraksjoner ble LPS og LOS ekstrahert og visualisert. Ekstraktene ble lastet på en polyakrylamidgel og farget med Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii er en topp prioritet, multi resistent, menneskelig patogen. Denne protokollen bør hjelpe forskere i å forstå rollene til lipooligosakkarider, fosfolipider og lipoproteiner i motstands- og virulensmekanismene til dette unike og viktige patogenet. Denne metoden er ideell for nedstrøms analyse av fosfolipider, glykolipder karbohydrater, proteiner og små molekyler som vanligvis eksisterer i de doble membranene av gram-negative bakterier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
