Immunology and Infection
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एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच का उपयोग एंटीबायोटिक Dereplication
Chapters
Summary October 17th, 2019
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हम एक मंच है कि एंटीबायोटिक दवाओं के dereplication के लिए isogenic एंटीबायोटिक प्रतिरोधी Escherichia कोलाई के एक पुस्तकालय का इस्तेमाल का वर्णन. बैक्टीरिया या कवक द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक की पहचान ई. कोलाई के विकास से कम हो सकती है जो अपने संबंधित प्रतिरोध जीन को व्यक्त करती है। यह मंच आर्थिक रूप से प्रभावी और समय-कुशल है।
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं की लागत प्रभावी और समय पर dereplication दोनों के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ टेम्पलेट अनुकूलन है। इसका मतलब यह है कि एक व्यक्ति दर्जी कर सकते है जो प्रतिरोध जीन है कि वे अपने पुस्तकालय टेम्पलेट में व्यापक या संकीर्ण सब्सट्रेट विशिष्टता के अपने वांछित स्तर के आधार पर शामिल करना चाहते हैं ।
उदाहरण के लिए, बीटा-लैक्टम ई.कोलाई टेम्पलेट को व्यक्त कर रहा है ताकि बीटा-लैक्टम और उनके विभिन्न उपवर्गों के अत्यधिक विशिष्ट डेरेप्लेशन की अनुमति दी जा सके। एक सेप्टिक तकनीक का उपयोग करना, एक बाँझ जलाशय से एक बाँझ जलाशय से एमएचबी समायोजित के पिपेट ५०० माइक्रोलीटर, ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली । तैयार एआरपी या MARP तनाव प्लेटों के साथ, एआरपी या MARP नक्शे के अनुसार ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली टीका लगाने के लिए एक एप्लिकेटर छड़ी का उपयोग करें ।
गहरी अच्छी तरह से थाली की सतह पर एक सांस सील झिल्ली रखें और इसे रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस, २५० आरपीएम पर इनक्यूबेट करें । यह सुनिश्चित करें कि दूषित कुएं न हों। एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, गहरी अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से 100 माइक्रोलीटर को बाँझ 96-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें।
प्रत्येक कुएं में बाँझ 50% ग्लाइस्रोल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। कम से कम पांच लाइब्रेरी प्लेट तैयार करें। बाँझ एल्यूमीनियम जवानों के साथ प्लेटों को कवर और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से बंद कर दिया है।
एल्यूमीनियम सील के शीर्ष पर प्लेट ढक्कन रखें और शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लकड़ी के एप्लीकेटर छड़ी का उपयोग करके, धीरे-धीरे एक स्ट्रेप्टोमाइसेस कॉलोनी की सतह से बीजाणुओं को कुरेदते हैं और इसे एक बाँझ ग्लास मनका और तीन मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसेस एंटीबायोटिक माध्यम से एक टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं। वातारण की अनुमति देने के लिए एक टोपी के साथ परीक्षण ट्यूब को ढीला बंद करें।
एक ही लकड़ी applicator छड़ी का उपयोग करना, एक पेट्री है बेनेट आगर युक्त पकवान पर एक बंध्यता नियंत्रण लकीर । २५० आरपीएम पर छह दिनों के लिए वातारण के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर बीज संस्कृति युक्त ट्यूब और छह दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बंध्यापन नियंत्रण प्लेट इनक्यूबेट । फिर, एक स्तर की सतह पर, डिरेप्लिकेशन प्लेटें तैयार करें।
गर्म बेनेट के एगर के 23 मिलीलीटर को एक सीरोलॉजिकल पिपेट में एएसपिरेट करें और आयताकार पेट्री डिश की सतह के पार समान रूप से 20 मिलीलीटर बांटें, जिससे हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए पिपेट में माध्यम के शेष को छोड़ दिया जा सके। प्लेट को ढक्कन से ढक दें। धीरे-धीरे प्लेट घुमाएं जब तक कि मध्यम प्लेट के सभी क्षेत्रों को कवर न करे और जब तक कि एगर पूरी तरह से सेट न हो जाए तब तक इसे परेशान न करें।
इसके बाद, एक अनुरेखण टेम्पलेट के रूप में आयताकार पेट्री डिश ढक्कन का उपयोग करके नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली शीट तैयार करें ताकि शीट्स डेरिसिपेशन प्लेट की सतह को फिट करें। चादरों को काटकर उन्हें बाँझ थैली में ऑटोक्लांव करें। अब, बंध्यता नियंत्रण प्लेट की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इनक्यूबेशन के छह दिनों के बाद कोई संदूषक मौजूद न रहे।
यदि संदूषण मुक्त है, तो आयताकार पेट्री डिश के ढक्कन को हटा दें और आयताकार पकवान में बेनेट के आगार की सतह पर बीज संस्कृति के पिपेट 200 माइक्रोलीटर। पूरी थाली की सतह में संस्कृति को समान रूप से फैलाने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें। पेट्री डिश की सतह पर संस्कृति के शीर्ष पर तैयार नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को स्थान देने के लिए, झिल्ली के निचले किनारे को पेट्री डिश के निचले किनारे पर संरेखित करें और धीरे-धीरे झिल्ली को नीचे के किनारे से प्लेट के शीर्ष किनारे पर लागू करें।
झिल्ली आगर इंटरफेस के बीच बनने वाले किसी भी हवा के बुलबुले को चिकना करने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि झिल्ली आगर को फ्लश कर रही है। झिल्ली जीवों को इसकी सतह पर स्पोरुलेट करने की अनुमति देती है जबकि माध्यमिक मेटाबोलाइट्स को नीचे के माध्यम में उत्सर्जित किया जा सकता है। ढक्कन को आयताकार पेट्री डिश पर वापस रखें और इसे एक सीलबंद प्लास्टिक बैग में उल्टा रखें।
छह दिन तक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। छह दिन के बाद, इनक्यूबेटर से डेडेप्लिकेशन प्लेट निकालें। बाँझ चिमटी का उपयोग करना, ध्यान से बेनेट के आगर की सतह से नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को हटा दें।
सुनिश्चित करें कि ओवरले को दूषित करने की संभावना को कम करने के लिए प्लेट के किनारों के चारों ओर केवल मामूली बीजाणु विकास है। सुनिश्चित करें कि काम की सतह स्तर है और गर्म यान समायोजित MHB आगर के 23 मिलीलीटर को शिक्षित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। 20 मिलीलीटर को समान रूप से डेडिलेशन प्लेट की सतह के पार वितरित करके एक ओवरले बनाएं, जिससे हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए पाइपेट में एगर के शेष को छोड़ दिया जा सके।
प्लेट पर ढक्कन रखें। धीरे-धीरे प्लेट घुमाएं जब तक कि माध्यम सभी क्षेत्रों को कवर न करे और इसे तब तक परेशान न करें जब तक कि एगर पूरी तरह से सेट न हो जाए। एक बार ठंडा और जम जाने के बाद, सीलबंद प्लास्टिक बैग में डेरेसेलिकेशन प्लेट वापस करें और इसे रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर उल्टा स्टोर करें, जिससे एमएचबी एगर ओवरले में माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के प्रसार की अनुमति मिलती है।
उसी दिन, एक ९६-अच्छी थाली के प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोलीटर को समायोजित करके एक ताजा एआरपी या मार्प टेम्पलेट टीका लगाएं। माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर जमे हुए स्टॉक एआरपी या MARP लाइब्रेरी प्लेट ले लो। इसके नीचे पर संघनन शुरू होने से पहले एल्यूमीनियम सील निकालें।
बाँझ 96-अच्छी तरह से पिनिंग टूल का उपयोग करना, जमे हुए स्टॉक एआरपी या मार्प लाइब्रेरी प्लेट से सावधानीपूर्वक पिन करें और 96-अच्छी प्लेटों वाले ताजा MHB को टीका लगाएं। डेरेशन के दौरान संदूषण को कम करने के लिए, पुस्तकालय प्लेट के प्रति केवल दो से तीन डेरेप्लिकेशन प्लेटों को डीरेप्लिकेट करने के लिए आवश्यक कई एआरपी या मार्प लाइब्रेरी प्लेट तैयार करें। एक बार पूरा होने के बाद, जमे हुए टेम्पलेट पर एक नया बाँझ एल्यूमीनियम सील डाल दिया और इसे शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वापस कर दें।
एक शिथिल सील प्लास्टिक की थैली के अंदर टीका ९६ अच्छी तरह से प्लेटें रखें और 18 घंटे के लिए २५० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इनक्यूबेटर से एआरपी या MARP टेम्पलेट निकालें और यह सुनिश्चित करें कि कोई संदूषक एआरपी या MARP टेम्पलेट नक्शे के लिए प्लेट की तुलना करके मौजूद हैं । चार डिग्री सेल्सियस से डेरेप्लिकेशन प्लेटों को हटा दें और कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें।
यदि संघनन है, तो ढक्कन खोलें और बाँझ वातावरण में सूखने दें। बाँझ पिनिंग उपकरण का उपयोग करना, एआरपी या MARP लाइब्रेरी प्लेट से पिन एमएचबी एगर ओवरले ऑफ डेरिटलेशन प्लेटों की सतह पर। सावधान रहें कि आगर में छेद न करें।
टेम्पलेट इनोकुलम को तीन से पांच मिनट तक सूखने दें। टीका लगाने वाली डेरेप्लिकेशन प्लेटों को एक सीलबंद प्लास्टिक बैग में उल्टा रखें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एआरपी या मार्प मानचित्र के अनुरूप कुओं के लिए डेरेप्लिकेशन प्लेट पर विकास की तुलना करके dereplication परिणामों का विश्लेषण करें।
इस एआरपी या MARP dereplication कार्यप्रवाह में, एक सकारात्मक dereplication परिणाम प्राप्त किया गया था । जिसमें स्ट्रेन डब्ल्यूएसी 8921 के लिए तैयार अर्क की पहचान क्लोरम्फेनिकोल निर्माता के रूप में की गई। एआरपी विकास की कमी या तो एक अज्ञात एंटीबायोटिक या एक कम आमतौर पर पाया एंटीबायोटिक है कि ARP या MARP पुस्तकालय प्लेट में हिसाब नहीं था की उपस्थिति इंगित करता है ।
एक विकास पैटर्न MARP के लिए अद्वितीय दोनों जंगली प्रकार ई.कोलाई BW25113 और एक अति पारगम्य और ई-प्रवाह की कमी उत्परिवर्ती ई.कोलाई BW25113 bamB tolC के उपयोग की वजह से गठन किया गया था। यह परिणाम रोगाणुरोधी गतिविधि के साथ एक यौगिक की उपस्थिति का सुझाव देता है जो एक अक्षुण्ण बाहरी झिल्ली को पार करने में असमर्थ था। यह ई.कोलाई विकास पैटर्न पिनिंग उपकरणों की अनुचित नसबंदी का सुझाव देता है, जिसके परिणामस्वरूप ओवरले में अज्ञात ई. कोलाई उपभेदों का हस्तांतरण होता है।
और एआरपी या MARP जमे हुए स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट संदूषण का एक उदाहरण यहां आयताकार पेट्री डिश सतह पर उगाया तीन अलग ई. कोलाई कालोनियों के साथ दिखाया गया है । यह परिणाम इंगित करता है कि आगर ओवरले को डीरेप्लिकेशन के दौरान छेदा गया था। एमएचबी ओवरले संबंधित संदूषण भी डेलेरेशन प्रक्रिया के दौरान हो सकता है, जो ओवरले की सतह पर अनियमित विकास पैटर्न दिखाता है।
इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि संदूषण के कारण आपको किसी भी कदम में वापस नहीं रखा जाता है ताकि उचित नसबंदी और एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग किया जा सके। इसमें नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली तैयार करना शामिल है ताकि यह बेनेट की आगर प्लेट की सतह को यथासंभव बारीकी से फिट कर सके ताकि एमएचबी ओवरले डालने पर बीजाणुओं के प्रसार को कम किया जा सके । इसके अतिरिक्त, सबसे साफ परिणाम का उत्पादन करने के लिए पुस्तकालय प्लेटों को बाहर निकालने और निष्क्रिय करते समय ठीक से निष्फल पिनिंग उपकरण का उपयोग करना भी अत्यंत महत्वपूर्ण है।
ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं को डीरेप्लिट करने के अलावा, इस विधि को उन एडजुवेंट की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है जिनका उपयोग मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिलकर उनकी गतिविधि को बचाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि एंटीबायोटिक dereplication एक नई तकनीक नहीं है, यह संसाधन गहन और समय लेने वाली होने के लिए कुख्यात है । एआरपी और MARP मंच कैसे एंटीबायोटिक dereplication एक बड़ा उत्पादन होने की जरूरत नहीं है पर एक प्रकाश डाला मदद करते हैं, बल्कि एक दो सप्ताह की अवधि में ंयूनतम उपकरणों का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है ।
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