Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Antibiotika Dereplication bruke antibiotikaresistens plattform
Chapters
Summary October 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en plattform som utnytter et bibliotek av isogenic antibiotika resistente Escherichia coli for dereplication av antibiotika. Identiteten til en antibiotika produsert av bakterier eller sopp kan utledes av veksten av E. coli uttrykke sine respektive motstand genet. Denne plattformen er økonomisk effektiv og tidseffektiv.
Transcript
Vår protokoll er betydelig fordi den gir både kostnadseffektiv og be stundvis duplisering av kjente antibiotika uten bruk av spesialisert utstyr. Den største fordelen med denne teknikken er maltilpasning. Dette betyr at en person kan skreddersy hvilke resistensgener som de ønsker å inkludere i bibliotekmalen basert på ønsket nivå av bred eller smal substratspesifisitet.
For eksempel uttrykker en beta-laktam E.coli-mal for å tillate svært spesifikk avregistrering av beta-laktam og deres ulike underklasser. Ved hjelp av en septikteknikk justerte pipette 500 mikroliter kation MHB fra et sterilt reservoar til hver brønn av en steril, 96 dyp brønnplate. Med de tilberedte ARP- eller MARP-stammeplatene, bruk en applikatorpinne til å inokulere den 96 dype brønnplaten i henhold til ARP- eller MARP-kartet.
Legg en pustende tetningsmembran på overflaten av den dype brønnplaten og inkuber den over natten ved 37 grader Celsius, 250 RPM. Sørg for at det ikke er forurensede brønner. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 100 mikroliter fra hver brønn av den dype brønnplaten til en steril 96-brønns rund bunnplate.
Tilsett 100 mikroliter sterile 50% glyserol i hver brønn og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned. Forbered minst fem bibliotekplater. Dekk platene med sterile aluminiumsforseglinger og sørg for at hver brønn er individuelt forseglet.
Plasser platelokket på toppen av aluminiumsforseglingen og oppbevar det på minus 80 grader Celsius. Ved hjelp av en treapplikatorpinne skraper du forsiktig sporer fra overflaten av en streptomyces koloni og overfører den til et reagensrør som inneholder en steril glassperle og tre milliliter streptomyces antibiotikamedium. Lukk røret løst med en hette for å tillate aerasjon.
Bruk samme treapplikatorpinne, strek en sterilitetskontroll på en petriskål som inneholder Bennetts agar. Inkuber røret som inneholder frøkultur ved 30 grader Celsius med vanning i seks dager ved 250 RPM og sterilitetskontrollplaten ved 30 grader Celsius i seks dager. Deretter, på et jevnt underlag, forberede dereplication plater.
Aspirer 23 milliliter varm Bennetts agar inn i en serologisk pipette og dispenser 20 milliliter jevnt over overflaten av en rektangulær petriskål, slik at resten av mediet i pipetten for å forhindre luftbobledannelse. Dekk platen med et lokk. Roter platen forsiktig til mediet dekker alle deler av platen og ikke forstyrr den før agaren er helt innstilt.
Deretter forbereder nitrocellulosemembranark ved hjelp av et rektangulært petriskållokk som en sporingsmal, slik at arkene passer til overflaten av avregistreringsplaten. Klipp arkene og autoklav dem i en steril pose. Kontroller nå sterilitetskontrollplaten for å sikre at ingen forurensninger er tilstede etter seks dager med inkubasjon.
Hvis kontamineringsfritt, fjern lokket på den rektangulære petriskålen og pipetten 200 mikroliter av frøkulturen på overflaten av Bennetts agar i den rektangulære parabolen. Bruk en steril bomullspinne for å jevnt spre kulturen over overflaten av hele platen. For å plassere den tilberedte nitrocellulosemembranen over toppen av kulturen på overflaten av petriskålen, juster den nederste kanten av membranen til den nederste kanten av petriskålen og påfør sakte membranen fra den nederste kanten til den øverste kanten av platen.
Bruk en steril bomullspinne for å glatte ut eventuelle luftbobler som kan ha dannet mellom membran agargrensesnittet, slik at membranen er flush til agaren. Membranen gjør det mulig for organismer å sporulate på overflaten mens sekundære metabolitter kan utskilles i mediet nedenfor. Sett lokket tilbake på den rektangulære petriskålen og legg det opp ned i en forseglet plastpose.
Inkuber ved 30 grader Celsius i seks dager. Etter seks dager, fjern deplication platen fra inkubatoren. Bruk sterile pinsett, fjern forsiktig nitrocellulosemembranen fra overflaten av Bennetts agar.
Pass på at det bare er mindre sporvekst rundt kantene på platen for å redusere sjansene for å forurense overlegget som skal legges til. Sørg for at arbeidsflaten er i nivå og bruk en serologisk pipette til å aspirere 23 milliliter varm kationjustert MHB agar. Lag et overlegg ved å dispensere 20 milliliter jevnt over overflaten av avregistreringsplaten, slik at resten av agaren i pipetten for å forhindre luftbobledannelse.
Plasser lokket på platen. Roter platen forsiktig til mediet dekker alle områder og ikke forstyrr den før agaren er helt innstilt. Når den er avkjølt og størknet, returnerer du dupliseringsplaten til den forseglede plastposen og oppbevarer den opp ned ved fire grader Celsius over natten, noe som åpner for diffusjon av sekundære metabolitter i MHB agaroverlegget.
Samme dag inokulerer du en ny ARP- eller MARP-mal ved først å pipettere 100 mikroliter kationjustert MHB i hver brønn av en 96-brønnsplate. Ta den frosne ARP eller MARP bibliotekplaten ut av minus 80 grader Celsius fryser. Fjern aluminiumsforseglingen før kondens begynner å danne seg på undersiden.
Bruk sterile 96-brønns festeverktøy, fest forsiktig fra den frosne ARP- eller MARP-bibliotekplaten og inokulerer den friske MHB som inneholder 96-brønnsplater. For å minimere kontaminering under avregistrering, klargjør så mange ARP- eller MARP-bibliotekplater som trengs for å bare forfalle to til tre forfallsplater per bibliotekplate. Når du er ferdig, legg en ny steril aluminiumsforsegling på den frosne malen og returner den til minus 80 grader Celsius fryser.
Plasser de vaksinerte 96-brønnplatene inne i en løst forseglet plastpose og inkuber ved 37 grader Celsius med risting ved 250 O/min i 18 timer. Fjern ARP- eller MARP-malen fra inkubatoren og kontroller at det ikke finnes forurensninger ved å sammenligne platen med ARP- eller MARP-malkartet. Fjern de dupliseringsplatene fra fire grader Celsius og la det likevekte til romtemperatur.
Hvis det er kondens, åpne lokkene og la det tørke i et sterilt miljø. Bruk sterile festeverktøy til å feste fra ARP- eller MARP-bibliotekplaten på overflaten av MHB agaroverlegget på de dupliseringsplatene. Vær forsiktig så du ikke pierce agaren.
La malen tørke i tre til fem minutter. Legg de vaksinerte dekripasjonsplatene opp ned i en forseglet plastpose og inkuber over natten ved 37 grader Celsius. Dagen etter analyserer du resultatene ved å sammenligne vekst på avregistreringsplaten med brønner som tilsvarer ARP- eller MARP-kartet.
I denne arbeidsflyten for ARP eller MARP-forlikasjon ble det oppnådd et positivt avvik. Hvor ekstraktet forberedt for stammen WAC 8921 ble identifisert som en kloramfenikol produsent. Mangelen på ARP vekst indikerer tilstedeværelsen av enten et ukjent antibiotika eller et mindre vanlig antibiotika som ikke ble redegjøret for i ARP eller MARP bibliotekplate.
Et vekstmønster som er unikt for MARP ble dannet på grunn av bruken av både vill type E.coli BW25113 og en hypergjennomtrengelig og e-fluks mangelfull mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dette resultatet antyder tilstedeværelsen av en forbindelse med antimikrobiell aktivitet som ikke var i stand til å overgå en intakt ytre membran. Dette E.coli vekstmønstre antyder feil sterilisering av festeverktøy, noe som resulterer i overføring av ukjente E.coli stammer over overlegget.
Og et eksempel på ARP eller MARP frossen lager bibliotek plate forurensning er vist her med tre forskjellige E.coli kolonier dyrket på rektangulær Petri parabolen overflaten. Dette resultatet indikerer at agaroverlegget ble gjennomboret under avregistrering. MHB-overlegget til relatert forurensning kan også forekomme under avregistreringsprosessen, som viser et uregelmessig vekstmønster på overflaten av overlegget.
Det viktigste å huske når du følger denne protokollen er å bruke riktig sterilisering og aseptiske teknikker for å sikre at du ikke holdes tilbake i noe trinn på grunn av forurensning. Dette inkluderer å forberede nitrocellulosemembranen slik at den passer til overflaten av Bennetts agarplate så nært som mulig for å minimere spredningen av sporer når mhb-overlegget helles. I tillegg er det også svært viktig å bruke riktig sterilisert festeutstyr når du vaksinerer bibliotekplatene og avfaller for å produsere det reneste resultatet.
I tillegg til å dereplicating kjente antibiotika, kan denne metoden brukes til å identifisere adjuvanser som kan brukes sammen med eksisterende antibiotika for å redde sin aktivitet. Selv om antibiotika dereplisering ikke er en ny teknikk, er det beryktet for å være ressurskrevende og tidkrevende. ARP- og MARP-plattformen bidrar til å belyse hvordan antibiotikadeplisering ikke trenger å være en stor produksjon, men kan heller fullføres over en to ukers periode ved hjelp av minimalt utstyr.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
