Immunology and Infection
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Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados
Chapters
Summary November 1st, 2019
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Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.
Transcript
A liberação de armadilhas extracelulares por neutrófilos e outras células imunes é importante na imunidade inata, mas também fortemente ligada a patologias inflamatórias. Muito pouco se sabe sobre esse processo em macrófagos, embora essas células tenham um papel crítico na resposta inflamatória. Este protocolo fornece um modelo humano primário in vitro de captura extracelular ou liberação de mastro.
Ele fornece um modelo para estudarmos um potencial crescimento fisiológico dessa estrutura in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que as células deste protocolo são células primárias isoladas das preparações do casaco de buffy humano. Não é necessário um passo de escoramento para diferenciar o monócito em macrófagos, o que contrasta com outras linhas celulares monocitos, como a linha celular THP-1.
Este protocolo é facilmente adaptado a outras células imunes, incluindo neutrófilo isolado e microglia. A armadilha extracelular produzida por macrófagos é muito frágil, por isso devem ser tomadas cuidados entre os passos para preservar a integridade das armadilhas manchadas. Em condições estéreis, prepare o meio de escoramento M1 adicionando ao meio cultural RPMI-1640 completo, interferon gama à concentração de 20 nanogramas por mililitro e lipopólise à concentração de um micrograma por mililitro.
Prepare a mídia de priming M2 adicionando interleucina 4 à mídia de cultura RPMI-1640 completa à concentração de 20 nanogramas por mililitro. Em condições estéreis, aspirar a mídia dos poços de placas de cultura de tecido semeados e cultivados contendo HMDM. Adicione cuidadosamente em cada poço, um mililitro de PBS estéril pré-aquecido a 37 graus Celsius.
Remova o buffer PBS e lave duas vezes adicionais. Adicione um mililitro da mídia de escoramento M1 ou M2 a cada poço contendo o HMDM. Incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono em uma incubadora celular.
Em condições estéreis, prepare a mídia cultural contendo diferentes estimuladores da versão MET para a mídia RPMI-1640 completa. Para experimentos com estimulação de ácido hipocloroe, prepare 200 ácido hipocloroe micromolar em um tubo Falcon com HBSS que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após o tratamento de polarização, aspire a mídia celular de cada poço e lave cuidadosamente as células três vezes com uma alíquota mililitro de PBS estéril para PMA, TNF alfa e estimulação interleucina 8 ou HBSS para estimulação de ácido hipocloro.
Depois de remover o PBS na etapa final de lavagem, adicione um mililitro de mídia completa contendo PMA, TNF alfa ou interleucina 8. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora celular por seis horas para estimulação alfa TNF e 24 horas para estimulação pma ou interleucina 8. Para experimentos com ácido hipocloros, depois de remover o HBSS na etapa final de lavagem, adicione um mililitro de ácido hipocloroe recém-preparado.
Em seguida, incubar as células por 15 minutos a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono em uma incubadora celular. Depois disso, aspire cuidadosamente o supernanato das células e lave as células três vezes com uma alíquota mililitro de HBSS. Depois de remover o HBSS da etapa final de lavagem, adicione um mililitro de mídia de cultura RPMI-1640 completa.
Em seguida, incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono em uma incubadora celular. Prepare o corante verde SYTOX no HBSS a uma concentração de 40 micromolar. Adicione diretamente 25 microliters do corante a cada poço contendo HMDM.
Incubar células à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro. Em seguida, coloque o HMDM em poços de cultura tecidual no estágio do microscópio de um microscópio fluorescente invertido para imagem. Ligue uma fonte de luz fluorescente de amplo espectro, fonte de luz de campo brilhante e microscópio invertido instalado com uma câmera digital colorida de alta resolução.
Gire a roda do filtro para a posição número dois para fluorescência verde com excitação a 504 nanômetros e dimensão a 523 nanômetros. Usando o objetivo 5X, concentre a imagem com o foco grosseiro, em seguida, o foco fino maçaneta no microscópio até que a imagem pareça nítida, clara e focada. Mude o microscópio para o modo câmera.
Inicie o software associado. Clique no botão Reproduzir para visualizar a imagem e ajustar o botão de foco fino no microscópio até que a imagem pareça nítida, clara e focada na janela de visualização do software. Clique no botão Capturar.
Dentro do software, clique em Arquivo. Salve como o tipo de arquivo de imagem necessário. No microscópio, gire a roda do filtro para a posição número cinco para imagens de campo brilhante e repita os procedimentos de captura para obter a imagem de campo brilhante correspondente.
Imagens de campo brilhante mostrando as alterações morfológicas do HMDM em resposta a estímulos são mostradas aqui. Macrófagos polarizados por M1 de experimentos com HMDM expostos à gama de interferon e lipopólise mostraram uma forma de célula alongada e semelhante a fuso. Para comparação, a morfologia dos macrófagos polarizados M2 após a exposição do HMDM à interleucina 4 por 48 horas foram tipicamente redondas e planas.
A capacidade de fenótipos HMDM diferenciados para liberar METs foi visualizada por imagens de fluorescência de células vivas com verde SYTOX. O controle obtido de cada fenótipo HMDM incubado por 24 horas na ausência de quaisquer estímulos pró-inflamatórios mostrou coloração verde muito limitada. A coloração positiva para METs, mostrada como listras verdes, foi alcançada com exposição de M1-HMDMs a ácido hipocloro, PMA, interleucina 8 ou TNF alfa.
A presença de algumas manchas verdes aparentes nas células reflete a perda de integridade da membrana que pode resultar da morte celular que é independente da liberação de armadilha extracelular. Os experimentos realizados com M2-HMDMs expostos à interleucina 4 não mostraram liberação de DNA das células, como indicado pela ausência dos fios ou listras de DNA extracelular. No entanto, houve alguma absorção celular de corante fluorescente verde com o ácido hipocloros e TNF alfa.
É importante evitar a luz direta e brilhante que pode expor demais a coloração antes da imagem. O DNA extracelular pode ser quantificado pela análise qPCR sobre DNA nuclear e mitocondrial presente no supernante celular. A caracterização adicional da estrutura do mastro e seus papéis na inflamação crônica usando HMDM pode ser mais clinicamente relevante em comparação com outros estoques de macrófagos de linha celular imortalizada.
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