Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Применение Live Cell Imaging и крио-электронной томографии для устранения пространственно-временной особенностей системы Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion
Chapters
Summary March 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Изображение бактериальных клеток является новым подходом биологии систем, ориентированных на определение статических и динамических процессов, которые диктуют функцию крупных макромолекулярных машин. Здесь для изучения архитектуры и функций системы секреции системы секреции legionella pneumophila IV типа используется интеграция количественной визуализации живых клеток и криоэлектронной томографии.
Transcript
Этот протокол полезен для характеристики монтажных функций бактериальных секреции комплексов и может привести к фундаментальному пониманию молекулярных механизмов, необходимых для взаимодействия патогенов-хозяина. Этот метод интегрирует дополнительные подходы, которые сохраняют родную структуру образца и позволяют и видят визуализацию белковых комплексов в нетронутых бактериальных клетках. Это увеличивает наше понимание структурных функциональных отношений бактериальных систем секреции.
Этот метод может быть адаптирован для изучения других типов систем секреции или других клеточных комплексов в широком спектре бактериальных видов. Начните с создания агарозы колодки для живой визуализации клеток. Подготовка около 30 мл 1%низкого раствора расплава агарозы в воде и микроволновой печи его в стеклянной колбе в течение примерно 90 секунд закрученного его время от времени, пока агароза полностью растворяется.
Поместите два 22 на 22 на 0,15 мм стеклянные слайды на краю 25 на 75 на 1,1 мм стеклянный слайд один поверх другого. Затем сложите еще два небольших слайда на другом краю. Pipette около 1 мл расплавленной агарозы в центре слайда между двумя верхними стеклянными горками и место другой большой слайд на вершине расплавленной агарозы убедившись, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
Охладить слайды при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, а затем использовать скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно разрезать площадку на небольшие квадратики. Зафиксирует двустороннюю клеевую раму на стеклянной горке 25 на 75 на 1,1 мм и поместите несколько колодок на горку. Растворите тяжелый участок Legionella Pneumophila в 1 мл двойной дистиллированной воды.
Затем вихрь и пипетка два-три микролитера разбавления на прокладки. Аккуратно поместите крышку 58 на 24 на 0,15 мм над клейкой рамой. Выберите ячейки для визуализации с помощью яркого освещения поля.
Затем, в окне захвата программного обеспечения микроскопа, отрегулируйте ND до 180 и биннинг на два на два. Используйте 488 нанометровый канал, чтобы выставить образец на 500-1000 миллисекунд и проверить специфичность флуоресценции с помощью изображений нетеговых Legionella Pneumophila с теми же параметрами. Чтобы количественно оценить полярность, отрегулируйте контраст изображения, чтобы бактерии были хорошо видны.
Затем увеличьте область интереса и используйте инструмент региона, чтобы поместить прямоугольник 0,25 на 1,3 микрометра, начиная с полюса и расширяясь в цитоплазму, убедившись, что прямоугольник остается в пределах бактериальных границ. Отметь не менее 200 бактерий и создайте маски, используя область для маскировки кнопки в меню анализа. Нажмите на статистику масок и выберите объект под маской.
Затем отметут среднее интенсивность и дисперсию по характеристикам и интенсивности. Экспорт данных в качестве текстового файла и использование приложения электронной таблицы для расчета полярности оценки каждой бактерии, как соотношение между дисперсией и среднего интенсивности. Для высокой пропускной способности приложения используют микроскопию контрастности лица для получения изображений двойного канала.
Убедитесь в том, чтобы выбрать поля зрения, где бактерии полностью разделены. Затем отрегулируйте контраст лица канала изображения до уровня, при котором бактерии хорошо видны. Откройте двойное изображение канала и запустите окно маски сегмента.
Отрегулируйте соответствующий порог, затем удалите небольшие объекты, нажав кнопку определения объектов и отрегулируя минимальный размер до 100 пикселей. Под маской уточнить, выберите удалить края объектов и отдельных масок бактерий, которые примыкают друг к другу. Для количественной оценки динамики белков синтеза откройте окно захвата изображения и отметь промежуток времени.
Введите два в поле времени точек. Приобрети два успешных изображения Legionella Pneumophila, выражающ флуоресцентный белок интереса. Отрегулируйте контраст изображения до тех пор, пока ячейки не будут хорошо видны.
Затем используйте инструмент региона, чтобы поместить квадрат 0,25 на 0,25 микрометра в середине не менее 400 ячеек. Далее используйте область, чтобы замаскировать кнопку в меню анализа, чтобы создать маску квадратов интереса. Создайте новую пустую маску и используйте пиксельный инструмент, чтобы отметить всю область ячейки, по крайней мере 25 случайных ячеек.
Создайте другую маску и используйте большой инструмент кисти, чтобы отметить области между ячейками. Наконец, выберите статистику масок и убедитесь, что объект выбран под маской для маски один. По функциям и интенсивности выбирайте средняя интенсивность.
Экспортировать данные и повторить процесс для маски 2. Для маски 3, выберите всю маску и экспортировать средняя интенсивность. Чтобы подготовить образец криотомографии электрона, вырастить тяжелый участок Legionella Pneumophila на пластинах CYE Agrastreptomisum в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию.
Переусердовать клетки в воде до OD 600 около 0,7. Затем добавьте пять микролитров коллоидных частиц золота в 20 микролитров клеточной суспензии. Свечение разряда дырявой углеродной сетки и пипетки пять микролитров клеточной смеси на нем.
Пусть это стоять в течение одной минуты. Пятно сетки с фильтровальной бумагой и заморозить его в жидком этан с помощью гравитационного аппарата поршень. После вставки суперфолдер GFP в хромосому Legionella Pneumophila, живая флуоресцентная микроскопия клетки была выполнена для сравнения флуоресцентного сигнала с родительским суперфолдерным отрицательным штаммом GFP.
Кроме того, для изучения доли клеток с определенным флуоресцентным сигналом использовалась яркая полевая микроскопия. Лишь часть клеток, которые произвели DotB суперфолдер GFP отображается поляризация синтеза белка. При характеристике распределения флуоресцентного сигнала DotB было установлено, что интенсивность суперфольбера DotB GFP на полюсах была примерно в два раза выше, чем в цитозоле.
Для исследования того, зависела ли полярная локализация DotB superfolder GFP от полностью собранной системы секреции типа 4, для отдельных клеток в диком типе и в мутанте системы секреции типа четыре были определены полярные баллы суперфолдерного GFP DotB. Действительно, полярное позиционирование суперфолькера DotB GFP исчезло, когда система Dot/ICM была удалена. Динамические модели показали, что DotB ATPase присутствует в динамической цитозолической популяции и был завербован в полярную локализованную систему секреции типа Dot/ICM на поздней стадии сборки.
Высокая пропускная способность крио-ET была использована для визуализации нетронутой типа четыре аппарата системы секреции в штамме Legionella Pneumophila, выражающего сверхтябрящий GFP DotB. Реконструкция ячейки выявила несколько машин Dot/ICM, встроенных в оболочку ячейки. Было также определено общее позиционирование DotB и суперфолдерного GFP по отношению к нетронутой машине системы секреции типа 4.
Трехмерные визуализации поверхности показали, что сверхтябрь GFP расположен ниже гексамера DotB, который собирается в качестве диска у основания цитоплазмического комплекса ATPase. При попытке этого метода, убедитесь, что для оценки стабильности синтеза белков и функциональность системы секреции тегов, прежде чем приступить к изображению приобретения. Моделирование и примерка могут быть эффективными способами анализа динамических моделей и структурной плотности, а также для оценки конформациальных изменений или локализации подразделений в структуру.
Такой подход может помочь понять, как функционируют секретные компоненты секретной системы типа четыре, как они взаимодействуют в рамках более сложного комплекса и какие функции выполняют различные подсемейные работы.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
