Bioengineering
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ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価
Chapters
Summary June 16th, 2020
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本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。
Transcript
このプロトコルは、前臨床生理学的薬物検査のためにドナー人間の心臓を採用するスキルを研究者に提供するため、重要です。この組織は、ヒト組織スライスにおける心行動電位と細胞内カルシウム過渡性の同時特性評価に電圧とカルシウム染料の両方を利用する。光学マッピングシステムを設定するには、下部ポリジメチルシロキサンゲル層を有する組織浴を灌流システムに取り付け、温度を維持し、浴透過物の蓄積を防ぐのに十分な速さで流量で灌流システムを通して100%酸素で酸素化した摂氏37度で1リットルの回収溶液を循環させる。
次に、ターゲットを使用して2台のCMOSカメラの焦点と位置合わせを調整し、520プラスマイナス5ナノメートルの波長の緑色のLED光源を使用して、電圧感受性とカルシウムインジケータの色素を同時に励起します。組織切片を得る前に、凍結した液状心筋痛液を混合し、心臓組織を氷冷心筋プレギア浴に入れ、左心室自由壁を特定する。ビブラートメの金属組織ホルダーの背面に、あらかじめ作られたアガロースゲルを接着します。
冷たい心肢麻痺溶液で組織の1センチメートルの立方体ブロックを切断し、局所皮膚接着剤を使用して、心内膜表面を上に向けて金属組織ホルダーに組織ブロックを素早く取り付けます。金属ホルダーを氷冷酸素スライス溶液のビブラードーム浴に移し、組織が完全に水没するようにし、ブレードを組織の前端に移動させます。ビブラートオムをオンにしてプリセットパラメータでスライスを開始し、ブレードがトラベキュラを越えて滑らかな心内膜組織に到達するまで最初のいくつかのスライスを破棄します。
実験組織に到達したら、室温酸素化タイローデの回収液を含む培養皿の個々の100マイクロメートルナイロンメッシュ細胞ストレーナーに各スライスを慎重に移し、メッシュワッシャーでスライスを覆い、組織スライスをカールしないようにします。すべてのスライスが収集されたら、各スライスを慎重に1ウェルあたり3ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。スライスを穏やかな揺れですすい、新鮮な滅菌PBSでこのプロセスを3回繰り返してから、サンプルを37°Cの培養培地を含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。
その後、37度、30%酸素、および5%の二酸化炭素で加湿インキュベーターで毎分20回転で軌道シェーカーにプレートを置きます。切り取りたてのスライスまたは培養直後の回収液中のインキュベーションの20分後、目的のスライスを灌流系組織浴に慎重に移し、組織に最小限のストレッチを適用しながら4つの角をゲル層に固定します。0.3~0.5マイクロリットルのストックブレビスタチンを回収液の貯留槽に加える前に、約10分間、循環回収液でスライスをこの浴中で休ませます。
スライスがブレビスタチンでインキュベートされている間、37度の回収溶液の1ミリリットルで30マイクロリットルのストック電圧感受性染料を再構成する。ブレビスタチン処理の10分後、ポンプをオフにし、30秒間にわたってスライスの表面に0.2〜0.3ミリリットルの作業色素溶液をゆっくりとロードします。90秒後、ポンプをオンにして余分な染料を洗い流します。
ちょうど実証したようにストックカルシウムインジケータでスライスを死にかけた後、スライスにカメラを集中させ、所定のペーシングしきい値の1.5倍の振幅で2ミリ秒のパルス幅持続時間を持つ1ヘルツでスライスのペースを調整します。ティッシュスライスの上にカバースリップを置き、LED励起光源でスライスを照らします。次に、1,000 フレーム/秒のカメラで、放出された電圧とカルシウム信号を記録します。
電圧およびカルシウム光学マッピングデータを条件として、適切な解析ソフトウェアで条件パラメータをクリックし、背景を削除します。次に、信号調節パラメータを調整して、最適な作用電位とカルシウム過渡トレースを得ます。伝導速度を計算するには、アクティブ化マップを選択し、開始時間と終了時間を入力して、トレース内の 1 つのアクションポテンシャルを包含します。
次に、[地域] マップをクリックし、対象地域を選択して、選択した地域のアクティブ化マップを表示します。次に、伝導速度マップを選択し、開始時間と終了時間を選択します。必要に応じて、設定に基づいてピクセル間解像度の値を調整します。
[ベクトル マップを生成]をクリックして対象領域を選択し、その領域内の伝導速度ベクトルを表示します。解析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、およびベクトル数、および選択した領域における伝導速度ベクトルの伝播の平均角度が表示されます。アクションの可能性期間を計算するには、アクションの潜在的な持続時間、カルシウム過渡期間マップを選択し、開始時間と終了時間を選択して、1 つのアクションの可能性を完全に包含します。
次に、[地域のアクションの可能性期間の計算] をクリックして、対象地域を選択し、アクション潜在的な期間マップを生成します。立ち上がり時間を決定するには、立ち上がり時間を選択し、開始時間と終了時間を選択して、1つのアクション電位またはカルシウム過渡のアップストロークを選択します。開始および終了のパーセンテージの値を入力し、[計算] をクリックして対象地域を選択し、上昇時間の解析に含まれる平均、中央値、標準偏差、ピクセル数を決定します。
カルシウムの崩壊を決定するには、カルシウム崩壊を選択し、開始時間と終了時間を入力して、単一のカルシウム過渡信号の減衰部分全体を包含します。次に、[τの計算] をクリックして対象領域を選択し、カルシウム崩壊時定数の解析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、およびピクセル数を決定します。本代表的実験では、作用電位及びカルシウム過渡痕をシグナル条件とした。
活性化時間は、活性化時間の各画素およびアイソクロナルマップについて、条件電圧およびカルシウムトレースからプロットした。伝導速度ベクトルは、活性化時間および既知のピクセル間解像度を用いて計算した。カルシウム過渡減衰定数は、カルシウムトレースの減衰部分に多項式を合わせて測定した。
作用電位持続時間及びカルシウム過渡持続時間は、それぞれ細胞質からの再分極またはカルシウム除去の活性化時間と指定されたパーセントの間の時間持続時間として測定した。電圧およびカルシウムトレースの立ち上がり時間も測定され、マッピングされました。この代表的な分析では、ドキソルビシンが心臓伝導に及ぼす影響を試験し、その結果、横断伝導速度が低下した。
スライス手順中の組織への損傷を最小限に抑え、実行可能なスライスを得るために、スライスが完全な心肢麻痺状態であることを確認することが重要です。プロトコルの最後に、スライスを凍結または分子評価のために固定することができます。その後、目的の電気生理学的現象に関与する機構経路を決定することができる。
このヒト心臓スライスモデルの開発により、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるヒト心臓組織における治療および疾患に対する反応の研究が可能になった。この技術を実行しながら、人間の組織を操作するときは、適切なPPEを着用し、他の必要な安全対策を講じてください。
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