Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تقييم الكهربائيات القلبية قبل الاحتكين بواسطة الجهد المزدوج ورسم الخرائط البصرية الكالسيوم لشرائح القلب العضوية البشرية
Chapters
Summary June 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالقطع و زراعة شرائح القلب البشرية لاختبار الأدوية قبل الفحص، وتفاصيل استخدام الخرائط البصرية لتسجيل الجهد عبر المُجمب وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد من هذه الشرائح.
Transcript
هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر للباحثين المهارات اللازمة لتوظيف قلوب الإنسان المانحة لاختبار المخدرات الفسيولوجية قبل السريرية. يستخدم هذا النسيج كل من صبغات الجهد والكالسيوم للتوصيف المتزامن لإمكانات عمل القلب وعابرين الكالسيوم داخل الخلايا في شرائح الأنسجة البشرية. لإقامة نظام رسم الخرائط البصرية، إرفاق حمام الأنسجة مع طبقة هلام البوليديميثيلسيلوكسيان السفلي إلى نظام الضخ وتعميم لتر واحد من محلول الاسترداد في 37 درجة مئوية أكسجين مع 100٪ الأكسجين من خلال نظام الضخ بمعدل تدفق سريع بما يكفي للحفاظ على درجة الحرارة ومنع تراكم الاستحمام.
ثم استخدام هدف لضبط التركيز والمحاذاة من اثنين من كاميرات CMOS واستخدام مصدر الضوء LED الخضراء مع 520 زائد أو ناقص خمسة نانومتر الطول الموجي لإثارة الجهد الحساسة والكالسيوم مؤشر الأصباغ في وقت واحد. قبل الحصول على أقسام الأنسجة، مزيج حل القلب نوبجيا المجمدة والسائلة ووضع أنسجة القلب في حمام القلب البارد الجليد وتحديد الجدار الحر البطيني الأيسر. الغراء هلام agarose مسبق الصنع إلى الجزء الخلفي من حاملي الأنسجة المعدنية من الهزاز.
قطع كتل مكعبة سنتيمتر واحد من الأنسجة في محلول القلب النابل البارد واستخدام لاصق الجلد الموضعي لتركيب بسرعة كتل الأنسجة على أصحاب الأنسجة المعدنية مع الأسطح بطانة القلب التي تواجه ما يصل. نقل أصحاب المعادن في حمام هزاز من الجليد الباردة الأوكسجين تقطيع حل بحيث يتم غمر الأنسجة تماما ونقل النصل إلى الحافة الأمامية من الأنسجة. بدوره على هزاز لبدء تشريح مع المعلمات مسبقا، والتخلص من الشرائح عدة الأولى حتى نصل إلى ما وراء trabeculae في الأنسجة بطانة القلب على نحو سلس.
عندما تم الوصول إلى الأنسجة التجريبية، نقل بعناية كل شريحة إلى 100 ميكرومتر شبكة مصافي خلايا النايلون في طبق ثقافة تحتوي على درجة حرارة الغرفة حل الانتعاش التيرود الأكسجين وتغطية الشرائح مع غسالات شبكة للحفاظ على شرائح الأنسجة من الشباك. عندما تم جمع جميع الشرائح، نقل بعناية كل شريحة في آبار فردية من لوحة ستة جيدا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني في بئر. شطف شريحة مع هزاز لطيف وتكرار هذه العملية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني عقيمة جديدة قبل نقل العينات إلى آبار فردية من لوحة ستة جيدا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 37 درجة مئوية ثقافة المتوسطة في بئر.
ثم ضع اللوحة على شاكر مداري بمعدل 20 ثورة في الدقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة، و30٪ أوكسجين، و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 20 دقيقة من الحضانة في حل الانتعاش لشرائح قطع طازجة أو مباشرة بعد الاستزراع، نقل بعناية شريحة من الفائدة إلى حمام الأنسجة نظام ضخ دبوس أسفل الزوايا الأربع إلى طبقة هلام مع تطبيق الحد الأدنى تمتد إلى الأنسجة. السماح لشرائح للراحة في هذا الحمام مع تعميم حل الانتعاش لمدة 10 دقائق تقريبا قبل إضافة 0.3 إلى 0.5 ميكرولترات من المخزون Blebbistatin إلى خزان حل الانتعاش.
في حين أن شريحة هو احتضان في Blebbistatin، إعادة تشكيل 30 ميكرولترات من الأسهم الجهد صبغة حساسة في ملليلتر واحد من حل الانتعاش في 37 درجة. بعد 10 دقائق من العلاج Blebbistatin، إيقاف المضخات وتحميل ببطء 0.2 إلى 0.3 ملليلتر من حل صبغة العمل على سطح شريحة على مدى فترة 30 ثانية. بعد 90 ثانية، قم بتشغيل المضخات لغسل أي صبغة زائدة.
بعد الموت شريحة مع مؤشر الكالسيوم الأسهم كما أظهرت للتو، والتركيز على الكاميرات على شريحة وسرعة شريحة في هرتز واحد مع اثنين من مللي ثانية مدة عرض نبض في 1.5 مرات من السعة من عتبة سرعة محددة سلفا. ضع غطاء على شريحة الأنسجة وأضيئ الشريحة بمصدر ضوء الإثارة LED. ثم سجل إشارات الجهد والكالسيوم المنبعثة مع الكاميرات في 1،000 لقطة في الثانية الواحدة.
لشرط الجهد والكالسيوم بيانات الخرائط البصرية، في برنامج التحليل المناسب، انقر فوق المعلمات شرط وإزالة الخلفية. ثم ضبط معلمات تكييف إشارة للحصول على إمكانات العمل الأمثل وآثار عابرة الكالسيوم. لحساب سرعة التشغيل، حدد خريطة التنشيط وأدخل وقت البداية والانتهاء ليشمل إمكانية إجراء واحد في التتبع.
ثم انقر على الخريطة الإقليمية وحدد المنطقة التي تهمك لعرض خريطة التنشيط للمنطقة المحددة. بعد ذلك، حدد خريطة سرعة التشغيل وحدد أوقات البداية والنهاية. ضبط قيم الدقة بين البكسل استناداً إلى الإعداد حسب الضرورة.
انقر فوق إنشاء خريطة متجه لتحديد منطقة ذات أهمية وعرض متجهات سرعة الاتّقل داخل تلك المنطقة. وسيُعرض متوسط ناقلات سرعة الاتّرَح، ومتوسطها، والانحراف المعياري، وعددها، وكذلك زاوية الانتشار المتوسطة لمتجهات سرعة الاتّّرَيْن في المنطقة المختارة. لحساب مدة الإجراء المحتملة، حدد مدة الإجراء المحتملة، وخريطة مدة الكالسيوم العابرة وحدد أوقات البدء والانتهاء لتشمل إمكانية إجراء واحدة كاملة.
ثم انقر فوق حساب المدة المحتملة للعمل الإقليمي لتحديد منطقة ذات أهمية وإنشاء خريطة المدة المحتملة للإجراء. لتحديد وقت الارتفاع، حدد وقت الارتفاع وحدد أوقات البداية والنهاية لتحديد ضربة أعلى لإمكانية إجراء واحد أو عابر الكالسيوم. أدخل قيم نسبة البداية والنهاية وانقر فوق حساب لتحديد المنطقة ذات الأهمية وتحديد الوسط، المتوسط، الانحراف المعياري، وعدد البيكسلات المضمنة في تحليل وقت الارتفاع.
لتحديد تسوس الكالسيوم، حدد تسوس الكالسيوم وأدخل أوقات البداية والنهاية لتشمل جزء الاضمحلال بأكمله من إشارة عابرة واحدة من الكالسيوم. ثم انقر فوق حساب تاو لتحديد المنطقة ذات الأهمية وتحديد الوسط، المتوسط، الانحراف المعياري، وعدد وحدات البكسل المضمنة في تحليل ثابت وقت اضمحلال الكالسيوم. في هذه التجربة التمثيلية، كانت إمكانات العمل وآثار الكالسيوم العابرة مشروطة بإشارة.
تم تحديد أوقات التنشيط لكل بكسل وخرائط العصور المُتَعَبَّدة لأوقات التفعيل تم رسمها من آثار الجهد والكالسيوم المُشروطة. تم حساب ناقلات سرعة التشغيل باستخدام أوقات التنشيط ودقة البكسل المعروفة. تم قياس ثابت اضمحلال الكالسيوم العابر عن طريق تركيب متعدد الحدود إلى الجزء المتحلل من آثار الكالسيوم.
تم قياس المدة المحتملة للعمل ومدة الكالسيوم العابرة كمدة زمنية بين وقت التنشيط ونسبة مئوية محددة من إزالة إعادة الاستقطاب أو الكالسيوم من السيتوبلازم على التوالي. كما تم قياس و تعيين أوقات صعود آثار الجهد والكالسيوم. في هذا التحليل التمثيلي، تم اختبار تأثير دوكسوروبيسين على عقد القلب مما أدى إلى انخفاض سرعة الإرسالية.
من المهم التأكد من أن الشرائح في القبض الكامل cardioplegic لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة أثناء عملية التقطيع والحصول على شرائح قابلة للحياة. في نهاية البروتوكول، يمكن تجميد الشرائح أو إصلاحها للتقييم الجزيئي. ويمكن بعد ذلك تحديد المسارات الميكانيكية التي تشارك في ظاهرة الفيزيولوجيا الكهربائية من الفائدة.
وقد سمح تطوير هذا النموذج شريحة القلب البشرية دراسة الاستجابات للعلاجات والأمراض في أنسجة القلب البشري سد الفجوة بين الدراسات الحيوانية والسريرية. عند العمل مع الأنسجة البشرية أثناء تنفيذ هذه التقنية، تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واتخاذ أي احتياطات السلامة اللازمة الأخرى.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
