Bioengineering
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人体器官性心脏切片双电压和钙光学映射的临床前心脏电生理评估
Chapters
Summary June 16th, 2020
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该协议描述了用于临床前药物测试的人体心脏切片切片和培养过程，并详细介绍了光学映射用于同时记录这些切片的跨膜电压和细胞内钙信号的过程。
Transcript
该协议意义重大，因为它为研究人员提供了利用捐赠者心脏进行临床前生理药物测试的技能。此组织利用电压和钙染料同时表征人体组织切片中的心脏作用电位和细胞内钙瞬变。要建立光学映射系统，将底部聚二甲基硅氧烷凝胶层的组织浴连接到灌注系统中，并在 37 摄氏度下循环一升回收溶液，用 100% 氧气通过灌注系统，以足够快的速度保持温度并防止沐浴灌注的积累。
然后使用目标调整两个 CMOS 摄像机的焦点和对齐方式，并使用波长为 520 正负 5 纳米的绿色 LED 光源同时激发电压敏感度和钙指示器染料。在获得组织部分之前，混合冷冻和液体心痛溶液，将心脏组织放入冰冷的心痛浴中，并识别左心室自由壁。将预制的阿加罗斯凝胶粘附到振动器的金属组织支架的背面。
在冷心肺溶液中切割一厘米的块状组织，并使用局部皮肤粘合剂快速将组织块安装到金属组织支架上，心内表面朝上。将金属支架转移到冰冷氧化切片溶液的振动池中，使组织完全被淹没，将刀片移动到组织的前边缘。打开振动器，开始用预设参数切片，丢弃前几个切片，直到刀片到达超过转形体进入光滑的心内组织。
当达到实验组织时，小心地将每片转移到单独的100微米尼龙网状细胞过滤器中，在培养皿中含有室温氧化Tyrode的恢复溶液，并用网垫圈覆盖切片，防止组织切片卷曲。收集所有切片后，小心地将每片转移到六孔板的单个孔中，每孔含有三毫升 PBS。用轻轻摇动冲洗切片，然后用新鲜无菌 PBS 重复此过程三次，然后将样品转移到六孔板的单个孔中，每孔含有 3 毫升 37 摄氏度培养介质。
然后将板以每分钟20转的速度放在一个加湿的培养箱中，温度为37度、30%氧和5%二氧化碳。在回收溶液中孵育20分钟后，小心地将感兴趣的切片转移到灌注系统组织浴，将四角固定到凝胶层，同时对组织进行最小的拉伸。让切片在此浴中休息约 10 分钟，然后向回收溶液储液中添加 0.3 至 0.5 微升库存 Blebbistatin。
当切片在 Blebbistatin 中孵育时，在 37 度的恢复溶液中，将 30 微升的库存电压敏感染料重新组成。经过 10 分钟的 Blebbistatin 处理后，关闭泵，并在 30 秒内缓慢地将 0.2 至 0.3 毫升的工作染料溶液加载到切片表面。90 秒后，打开泵以洗掉多余的染料。
在使用库存钙指示器的切片死亡后，将摄像机聚焦到切片上，以两毫秒脉冲宽度持续时间以 1.5 倍于预定起搏阈值的振幅的速度将切片以 1 赫兹的速度移动。在组织切片上放置盖玻片，使用 LED 激励光源照亮切片。然后以每秒 1，000 帧的速度记录摄像机发出的电压和钙信号。
要条件电压和钙光学映射数据，在相应的分析软件中，单击条件参数并删除背景。然后调整信号调节参数，以获得最佳作用电位和钙瞬态痕迹。要计算传导速度，请选择激活图并输入开始和结束时间，以包含跟踪中的单个操作电位。
然后单击区域地图并选择感兴趣的区域以显示所选区域的激活映射。接下来，选择传导速度图，然后选择开始和结束时间。根据需要根据设置调整像素间分辨率值。
单击生成矢量贴图以选择感兴趣的区域并显示该区域内的传导速度向量。将显示分析中包含的均值、中位数、标准差和矢量数，以及选定区域传导速度矢量的平均传播角度。要计算动作潜在持续时间，请选择动作潜在持续时间、钙瞬态持续时间图并选择开始和结束时间以包含一个完整的动作潜力。
然后单击区域操作潜在持续时间计算以选择感兴趣的区域并生成操作潜在持续时间图。要确定上升时间，请选择上升时间并选择开始和结束时间，以选择单个动作电位或钙瞬变的向上冲程。输入开始和结束百分比值，然后单击计算以选择感兴趣区域并确定上升时间分析中包含的平均值、中位数、标准偏差和像素数。
要确定钙衰变，请选择钙衰变并输入开始和结束时间，以包含单个钙瞬态信号的整个衰变部分。然后单击计算 tau 以选择感兴趣的区域，并确定钙衰减时间常数分析中包含的平均值、中位数、标准偏差和像素数。在这个具有代表性的实验中，作用潜力和钙瞬态痕迹被信号调节。
确定了每个像素的激活时间，并且从条件电压和钙痕迹绘制了激活时间等时映射。使用激活时间和已知的像素间分辨率计算传导速度向量。钙瞬态衰变常数是通过在钙痕迹的衰变部分上安装一个多项式来测量的。
作用潜力持续时间和钙瞬态持续时间分别测量为激活时间与从细胞质中重新极化或钙去除的指定百分比之间的持续时间。还测量和映射了电压和钙痕迹的上升时间。在此代表性分析中，测试了多索鲁比辛对心脏传导的影响，从而降低横向传导速度。
请务必确保切片完全在心肺恢复中，以在切片过程中最大限度地减少对组织的损害，并获得可行的切片。在协议结束时，可以冻结或固定切片进行分子评估。然后可以确定涉及电生理现象的机械通路。
这种人类心脏切片模型的发展使得人类心脏组织对治疗和疾病的反应的研究填补了动物与临床研究之间的差距。在执行此技术时，当使用人体组织时，请务必佩戴适当的 PPE 并采取任何其他必要的安全预防措施。
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