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Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Journal (Bioengineering)

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Journal (Bioengineering)

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

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Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

Article DOI: 10.3791/60841-v

February 25th, 2020 •

Shelby R. Svientek¹, Dan C. Ursu¹, Paul S. Cederna^1,2, Stephen W. P. Kemp^1,2

¹Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Chapters

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February 25th, 2020

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Das folgende Manuskript beschreibt eine neuartige Methode zur Entwicklung eines biologischen, geschlossenen neuronalen Feedbacksystems, das als zusammengesetzte regenerative periphere Nervenschnittstelle (C-RPNI) bezeichnet wird. Dieses Konstrukt hat die Fähigkeit, mit peripheren Nerven zu integrieren, um effelösenmotorische Signale zu verstärken und gleichzeitig eine affete sensorische Rückmeldung zu liefern.

Transcript

Unser Protokoll ist insofern von Bedeutung, als es eine gleichzeitige motorische Nervensignalverstärkung neben der Bereitstellung einer affegenden sensorischen Nervenstimulation durch die Nutzung einer biologischen peripheren Nervenschnittstelle ermöglicht. Diese Technik kann ein lebensechte sprothetisches Gerät für Menschen mit Amputationen bieten, da der C-RPNI gleichzeitige Motorsteuerung und sensorische Rückkopplung innerhalb derselben peripheren Nervenschnittstelle ermöglicht. Viele von denen, die mit Amputationen leben, verlassen fortschrittliche neuroprothestische Geräte, weil die Geräte keine intuitive Kontrolle und sinnvolles sensorisches Feedback haben.

Diese Technik bietet beides und kann die Aufgabe von Prothesengeräten verhindern. Diese Technik könnte auf Personen mit schwachen oder fehlenden Gliedmaßen oder sensorischen Defiziten angewendet werden, die weitere Einblicke in Feedbacksysteme bieten, die eine präzise und intuitive Extremitätskontrolle ermöglichen. Eine Operation an peripheren Nerven ist schwierig, da es wenig Spielraum für Fehler gibt.

Der Einsatz hochwertiger Instrumente und das Üben sind oft die besten Möglichkeiten, um den Erfolg zu sichern. Chirurgische Techniken sind unglaublich schwer zu vermitteln und von einem literarischen Format zu lernen. Die Beobachtung jedes einzelnen Schritts, der an der Konstruktionsfertigung beteiligt ist, ist der Schlüssel zum Beherrschen der Methode.

Um ein Hauttransplantat zuzubereiten, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, Salbe auf die Augen der anästhesierten Ratte auftragen. Mit Clippers, rasieren Sie die gesamte untere Hinterblinke, Knöchelbereich und Seiten der Pfote. Desinfizieren Sie das ausgewählte Hinterglied in der Pflanzoberfläche der Pfote mit einer sequenziellen Alkohol-Iodopovidon-Lösung und Alkoholreinigung.

Mit einem Hand-Mikromotor-Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem abnehmbaren runden feinen Sandpolierstein, gratfen Sie die Plantaroberfläche der Pfote, um die Epidermis mit einer Geschwindigkeit von 4.000 Umdrehungen pro Minute zu entfernen, indem Sie Tropfen Kochchen auftragen, um die Haut nicht zu verbrennen. Die zugrunde liegende Dermis wird ein glänzendes Aussehen mit punktgenauen Blutungen haben. Tragen Sie ein Tourniquet auf die untere Extremität auf, um den Blutfluss zu verlangsamen und verwenden Sie ein Skalpell der Nummer 15, um die Plantarhaut scharf zu entfernen.

Legen Sie die Haut in salzige befeuchtete Gaze, um Austrocknung zu verhindern und wenden Sie eine Gaze wickeln auf den blutenden Fuß, um Blutungen zu verlangsamen. Legen Sie die Haut unter ein Sezieren des Mikroskops und verwenden Sie Mikroscheren, um pflegende und Bindegewebe aus der tiefen Schicht des Hauttransplantats zu entfernen. Das verdünnte dermale Transplantat sollte leicht undurchsichtig sein, nur Dermis enthalten und etwa 0,5 mal einen Zentimeter groß sein.

Dann legen Sie das Gewebe in ein neues Stück saline befeuchtete Gaze bis zur Konstruktion. Um ein Muskeltransplantat vorzubereiten, verwenden Sie ein Skalpell der Reihe 15, um einen Längsschnitt entlang des vorderen Aspekts des unteren Hinterglieds von knapp über dem Knöchel bis knapp unterhalb des Knies zu machen. Sezieren Sie durch das subkutane Gewebe, um die zugrunde liegende Muskulatur zu entlarven.

Am distalen Aspekt des Schnittes, entlarven Sie die tendenziösen Einfügungen der unteren Gliedmaßenmuskulatur. Das Tibialis-Vorderteil ist typischerweise der größte und vordereste der Muskeln. Direkt unter und hinter diesem Muskel liegt der Extensor digitorum longus.

Um den distalen Extensor digitorum longus sehne von den anderen Sehnen im Bereich zu isolieren, legen Sie beide Dosen einer Zange unter der Sehne ein und öffnen Sie die Zange, um den Aufwärtsdruck auszutreiben, um eine Sehnenexkursion zu verursachen. Die Manipulation der Sehne sollte dazu führen, dass alle Zehen gleichzeitig verlängert werden. Verwenden Sie scharfe Irisschere, um eine distale Tenotomie durchzuführen und verwenden Sie Tenomoties, um den Muskel unverblümt vom umgebenden Gewebe zu trennen, das proximal arbeitet, um den tendenziösen Ursprung zu finden.

Sobald die proximale Sehne visualisiert werden kann, verwenden Sie die Irisschere, um eine zweite Tenotomie durchzuführen und legen Sie das Muskeltransplantat in eine saline befeuchtete Gaze. Zur Isolierung und Herstellung des gemeinsamen Peronealnervs einen Oberschenkel rasieren und die exponierte Haut mit einer sequenziellen Alkohol-Betadine-Alkoholreinigung desinfizieren. Legen Sie die anästhesierte Ratte auf ein Heizkissen unter einem chirurgischen Mikroskop und markieren Sie den Schnitt von nur distal bis zur Ischiaskerin auf den unteren Teil des Knies, der schlechter und vom Oberschenkelknochen abgewinkelt ist.

Dann verwenden Sie eine Zahl 15 Skalpell, um einen Schnitt entlang der Marke durch die zugrunde liegenden Bizeps femoris fascia zu machen. Sezieren Sie vorsichtig durch den Bizeps femoris Muskel in den Raum, der dem Bizeps femoris zugrunde liegt. Nach der Identifizierung des gemeinsamen Peronealnervs verwenden Sie mikrofein gekippte Zangen und Mikroscheren, um den gemeinsamen Peronealnerv sorgfältig von den anderen Ischiaszweigen zu isolieren.

Entfernen Sie alle verweilenden Bindegewebe distally und an der Stelle, an der der Nerv die Oberfläche des Knies kreuzt, schneiden Sie den Nerv mit einem Paar Mikroschere scharf. Dann befreien Sie vorsichtig das verbleibende Bindegewebe vom gemeinsamen Peronealnerv und arbeiten proximal, um den Nerv auf eine Länge von etwa zwei Zentimetern zu befreien. Nerven sind empfindlich und kleine Fehltritte können dauerhafte funktionstüchtige Defizite verursachen.

Häufige Praxis, präzise chirurgische Instrumente und ideale Handpositionierung und Unterstützung sind der Schlüssel zur Beherrschung dieser Technik. Um das C-RPNI-Konstrukt herzustellen, legen Sie das Muskeltransplantat unter das Sezierendes Mikroskop und entfernen Sie das gesamte zentrale Sehnengewebe sowie ein kleines zentrales Segment von Epimysium, das die sehnenförmigen Enden intakt lässt. Verwenden eines 8-0 Nylon-Nähte und zwei unterbrochene Stiche sichern das Epineurium des transectierten Endes des gemeinsamen Peronealnervs im Bereich des Muskeltransplantats ohne Epimysium auf beiden Seiten des Nervs.

Sichern Sie das Muskeltransplantat an der Oberschenkelmur periosteum mit einem einzigen 6-0 Nylon unterbrochen Stich sowohl proximal und distally mit dem Nervenmuskel-Kreuzung weg vom Oberschenkelknochen. Platzieren Sie eine 8-0 Nylonstich am unteren zentralen Rand des Muskeltransplantats Epimysium, der es dem gemeinsamen Peronealnervenepineurium sichert, um Eineführkraft im Nerv innerhalb des Muskeltransplantats zu erzeugen. Positionieren Sie das Hauttransplantat auf dem Muskeltransplantat, so dass es den Nerv und den Großteil des Muskels vollständig mit dem tiefen Rand der Dermis bedeckt, der auf dem Muskel ruht.

Trimmen Sie jede Dermis, die über die Grenze des Muskels erstreckt und verwenden Sie 8-0 Nylon unterbrochennähte Nähte, um das Hauttransplantat am Muskeltransplantat zu sichern. Schließen Sie den Bizeps femoris fascia über dem Konstrukt in laufender Manier mit 5-0 chromischer Naht und schließen Sie die darüber liegende Haut mit einer 4-0 chromischen Naht in laufender Manier. Dann tauschen Sie den chirurgischen Bereich mit einem Alkoholpad und wenden Sie Antibiotikum Salbe an, bevor sie der Ratte erlaubt, sich mit Nahrung und Wasserquellen zu erholen, die von Käfigkameraden getrennt sind, mit Überwachung bis zur vollständigen Restaunz.

Wenn erfolgreich, chirurgische Exposition der Konstrukte nach drei Monaten wird re-vaskulären Muskel und Haut und sanfte Squeezing des gemeinsamen Peronealnervmit mit Zangen proximal zum Konstrukt wird zu einer sichtbaren Muskelkontraktion führen. Histologische Analysen sollten lebensfähige Haut, Nerven und Muskeln nachweisen. Immunostaining wird auch motorische und sensorische Nervenrenervation zu ihren neuromuskulären Knoten und sensorischen Endorganen zeigen.

An diesen Konstrukten können elektrophysiologische Tests in vivo durchgeführt werden, wie z.B. drei und neun Monate nach der C-RPNI-Fertigung nachgewiesen. Hier werden Einzel- und Summations-Compound-Muskelwirkungspotentiale und zusammengesetzte sensorische Nervenaktionspotentiale, die während elektrophysiologischer Tests in einem grafischen Format erhalten wurden, gezeigt. Suboptimale Ergebnisse am Muskeltransplantat werden durch abgeschwächte Signale angezeigt, denen die charakteristische zusammengesetzte Muskelwirkungspotenziale fehlen.

Suboptimale Ergebnisse auf der Ebene der dermalen Komponente beinhalten in der Regel eine Dämpfung der Wellenform mit signifikantem Hintergrundrauschen. Instrumente von guter Qualität sind von entscheidender Bedeutung. Die Schere sollte scharf sein und die Zange sollte fein gekippt werden, um eine extrem präzise Handhabung der dermalen Transplantate und Nerven ohne Beschädigung zu ermöglichen.

Nach der Herstellung kann diese Methode in elektrophysiologischen Untersuchungen eingesetzt werden, um die Signalfähigkeiten weiter zu charakterisieren und mehr Einblick in effetierische und affete Rückkopplungsschleifen zu geben. Obwohl der C-RPNI sensorisches Feedback ermöglicht, ist unklar, ob ein Closed-Loop-Feedback-System für Propriozeption eingerichtet werden kann. Diese Frage werden derzeit im Labor behandelt.

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