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Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

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Journal (Developmental Biology)

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Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Article DOI: 10.3791/60843-v • 10:24 min

May 24th, 2020 •

Hsueh Fu Wu^1,2, Nadja Zeltner^1,2,3

¹Center for Molecular Medicine, University of Georgia, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, ³Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

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May 24th, 2020

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Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Transcript

Ce protocole permet la dérivation des neurones sympathiques des cellules souches pluripotentes humaines. Ces cellules permettront à un scientifique d’étudier les troubles humains qui affectent le système nerveux sympathique. Cette technique permet la dérivation de neurones sympathiques dans des conditions de réunion divisées sans mangeoire à une efficacité évolutive élevée.

Il en résulte des neurones électriquement actifs en 20 jours. Cette technique peut être appliquée aux maladies causées par un système nerveux sympathique dysfonctionnel, il peut également être utilisé pour la modélisation des maladies, la médecine régénérative, et le dépistage des médicaments. Ces cellules pourraient être utilisées in vitro pour innover n’importe quel tissu dans un système de co-culture, par exemple, pour l’étude de la régulation des tissus cardiaques.

Lorsque la culture des cellules souches pluripotentes humaines atteint 80 à 90% de confluence, de grandes colonies aux bords lumineux lisses doivent être observées. Pour la division, laver la culture avec PBS avant de traiter les cellules avec quatre millilitres de 0,25 molaire EDTA à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après deux minutes, rincer la plaque avec 10 millilitres de milieu E8 et transférer la suspension cellulaire détachée dans un tube conique de 15 millilitres.

Puis transférer 500 microlitres de cellules dans un aliquot de 9,5 millilitres de milieu E8 frais. Et plaquez les cellules souches sur de nouveaux plats de 100 millimètres recouverts de vitronectin. Un jour avant l’induction de différenciation, enduire le nombre approprié de six plaques de puits de deux millilitres de matrice membranaire sous-sol par puits.

Et rangez les assiettes à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, réchauffez les assiettes à température ambiante et lavez deux fois la culture de cellules souches pluripotentes humaines avec du PBS frais par lavage. Après le deuxième lavage, traiter les cellules avec sept millilitres de 0,5 millimolaire EDTA pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire avant d’aspirer les cellules souches pluripotentes humaines flottantes et de transférer les cellules récoltées dans un tube de 50 millilitres.

Ajouter un volume égal de PBS au tube pour diluer l’EDTA et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en un millilitre de milieu de différenciation jour 01 avant d’ajouter un volume approprié de support pour la comptabilité. Diluer les cellules à un 1,25 fois 10 à la cinquième cellule par concentration centimètre carré en millilitres de milieu de différenciation par puits.

Aspirez toute la solution matricielle membranaire du sous-sol de chaque puits de la plaque de six puits précédemment préparée. Puis ensemencer deux millilitres de cellules dans chaque puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, nourrir les cellules avec trois millilitres de jour 01 milieu de différenciation par puits.

Le deuxième jour de différenciation, nourrir les cellules avec trois millilitres de jour deux à 10 milieu de différenciation par puits, puis nourrir les cellules tous les deux jours jusqu’au jour 10. Pour agréger les cellules de crête neurale en sphéroïdes, le jour 10, laver les cellules avec PBS. Et ajouter deux millilitres de milieu de dissociation à chaque puits.

Après 20 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, transférer les cellules flottantes dans un tube conique de 50 millilitres et porter le volume de suspension dans le tube à 50 millilitres avec PBS frais. Recueillir les cellules par centrifugation. Et resuspendez la pastille dans un volume suffisant de jour 10 à 14 milieu sphéroïde pour le comptage.

Après comptage, diluer les cellules à cinq fois 10 à la cinquième cellule par concentration de 500 microlitres en utilisant le jour 10 à 14 milieu sphéroïde. Et plaquez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra faible de 24 puits. Retournez ensuite les cellules à l’incubateur de culture cellulaire.

Pour induire une culture sphéroïde minimale, le jour 11 de la culture, nourrir les sphéroïdes de crête neurale avec 500 microlitres supplémentaires de jour 10 à 14 milieu sphéroïde par puits. Le jour 12, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes d’un côté de la plaque. Et aspirez soigneusement autant de médium que possible de chaque puits sans aspirer les sphéroïdes.

Puis nourrir les sphéroïdes avec un millilitre de jour 10 à 14 milieu sphéroïde par puits. Pour induire une culture sphéroïde élargie, le jour 15, nourrir les sphéroïdes avec 1,5 millilitres de jour 10 à 14 milieu sphéroïde complété par 0,5 micromolaire acide rétinoïque par puits. Retournez ensuite les sphéroïdes à l’incubateur de culture cellulaire.

Pour une différenciation sympathique des neurones, le jour 14 ou 28, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes d’un côté de la plaque et aspirez soigneusement autant de médium que possible. Nourrissez les cellules avec un millilitre de neurone sympathique moyen. Pour décomposer les gros agrégats sphéroïdes en sphéroïdes plus petits, n’ajoutez pas plus d’un millilitre de milieu par puits et pipettez les sphéroïdes cinq à dix fois avant de les diviser.

Et enlever l’excès de fibronectine laminine des plaques de 24 puits préparées précédemment. Divisez la plaque d’un millilitre de sphéroïdes de chaque puits sur la plaque de culture sphéroïde de 24 puits entre quatre puits distincts de la nouvelle plaque enduite de 24 puits. Ajouter 250 microlitres de neurones sympathiques frais à chaque puits.

Et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, remplacer le milieu dans chaque puits par un millilitre de neurone sympathique moyen complété par 0,125 micromolar acide rétinoïque et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après le jour 35, nourrir les neurones en remplaçant soigneusement seulement la moitié du milieu existant dans chaque puits avec un milieu frais.

Avant la différenciation, les colonies de cellules souches pluripotentes humaines devraient être rondes avec des bords brillants et lisses et peu ou pas de différenciation. Les cellules expriment le marqueur de crête neuronale Sox10 des jours quatre à 10. Les cellules de crête neurale émergent dans les crêtes foncées denses qui sont visibles dès le sixième jour.

Ces crêtes expriment également Sox10. Au stade des cellules de crête neurale, Sox10 est en corrélation avec le marqueur de surface cellulaire CD49D, qui peut être utilisé pour trier les cellules de crête neurale. Les populations triées et non triées positives ont produit des sphéroïdes de crête neurale d’une manière semblable.

Bien que les cellules triées négatives ne s’agrègent pas correctement, ne produisent pas de sphéroïdes ronds et lisses à l’air sain et meurent dans les trois à quatre jours. En outre, quand des sphéroïdes neuronaux de crête sont comparés au jour 14, le PCR de transcriptase inverse quantitatif pour la crête neurale et les marqueurs sympathiques d’ancêtre de nerf, les différences significatives entre les cellules triées et non triées ne peuvent pas être détectées. Le jour 20 ou 35, les protocoles minimaux ou étendus respectifs, les neuroïdes peuvent être observés se développer dans un modèle radial des sphéroïdes attachés.

Des marqueurs liés à la synthèse et au transport de la noradrénaline sont exprimés à ce stade, ainsi que hox6 à travers neuf gènes de crête neurale du tronc. L’enregistrement électrophysiologique détecte également l’activité neuronale à partir du jour 20. Une telle activité peut être améliorée ou supprimée par des médicaments qui ciblent les autorécepteurs des neurones sympathiques en ajustant la fonctionnalité des neurones différenciés.

Le promoteur humain lui-même doit être en bonne santé à partir du jour zéro de différenciation, sinon, l’expérience échouera probablement. Des inhibiteurs pharmacologiques ou des activateurs peuvent être ajoutés aux neurones pour comprendre leur comportement normal ou pathologique. Cette méthode ouvre une nouvelle voie pour étudier la biologie sympathique et la pathologie puisqu’il est maintenant possible d’obtenir facilement des biopsies de neurones sympathiques de l’homme.

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