Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen
Chapters
Summary April 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.
Transcript
Onze zebrafish xenograft drug screening workflow zorgt voor geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering van menselijke kankercellen en hun reactie op medicamenteuze behandeling. Het kan worden gebruikt om snel te testen van de reactie van kankercellen van een geduld op bekende geneesmiddelen of om nieuwe antikanker verbindingen te identificeren. Met behulp van zebravis xenograaf modellen en drug screening zorgt voor Inviva replicant nummers die voorheen alleen verkrijgbaar waren met in vitro systemen.
Het is ook veel kosteneffectiever dan muismodellen bij het screenen door middel van grote bibliotheken van verbindingen. Deze workflow heeft verschillende stappen van interjectie van kankercellen in zebravissen tot beeldvorming van de reactie van geneesmiddelen die het beste worden geleerd door visuele demonstratie. Om te beginnen, centrifugeren een minimum van twee keer 10 tot de zesde cellen in vijf millimeter PBS op 200 keer g gedurende vijf minuten, en aspirate de supernatant.
Resuspend het celpalet in vijf millimeter dii kleuroplossing. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius beschermd tegen licht gedurende 20 minuten. Dan vortex voorzichtig en incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.
Centrifugeer de cellen vervolgens vijf minuten op 200 keer g en loker de supernatant aan. Was de cellen door het toevoegen van vijf milliliter PBS, centrifugeren op 200 keer g gedurende vijf minuten, en aspirating de supernatant. Herhaal de was een extra tijd.
Resuspend de cellen in een microliter van PBS per 250 duizend levende cellen en breng ze naar een 1,5 millimeter micro centrifuge buis. Houd de geresuspended cellen op ijs in het donker. Voorafgaand aan het bevlekken van cellen en injecteren, maak agarose platen voor het injecteren door gieten 25 millileeriers van drie procent agarose in 1X TBE in een petrischaal en laat het stollen.
Bewaar de platen maximaal twee weken op vier graden Celsius. Ook voorafgaand aan het beitsen van cellen en injecteren, dechlorinate twee dagen na bevruchting zebra vissen met behulp van tangen onder een ontleden microscoop. Trek van de tegenovergestelde einden van het beschermende chorion van de zebravissen met tangen tot de chorionscheuren en de zebravissen unenveloped worden.
Om klonteren van cellen tijdens microinjectie te voorkomen, pre chill niet filamenteuze borosilicaat glasnaalden op vier graden Celsius of op ijs. Onmiddellijk na het bevlekken van cellen, gebruik maken van een microloader pipet tip om vijf microliter van gekleurde cellen te laden in de gekoelde naald. Laad de naald in de microinjectorarm.
Niveau van de naald tip met behulp van een steriel scheermesje. Met behulp van een fase micrometer, meet de druppelgrootte in minerale olie. Houd het druppelvolume constant op twee nanoliter, dat is ongeveer 1,5 millimeter in diameter.
Breng de verdoofde larven een minuut na de verdoving over op een voorbereide vlakke oppervlakteinjectieplaat met drie procent agarose en injecteer de larven met één pomp gekleurde cellen op de gewenste injectieplaats. Alle injecties moeten binnen één tot drie uur na het bevlekken van de cellen worden voltooid om samenklonteren van de naald te voorkomen. Was de larven van de injectieplaat in een petrischaaltje van 10 centimeter met E3-media zonder methyleenblauw en incubeer bij 28 graden Celsius gedurende een herstelperiode van een uur.
Verplaats de schotel van de geïnjecteerde larven in een 34 graden Celsius incubator. Met een lege petrischaal geplaatst tussen de plank en de petrischaal van larven om als buffer te fungeren. Bij 48 uur na injectie screenen zebravissen larven op fluorescerende tumorcelen engraftment en gezondheid.
Verwijder dode of misvormde zebravissen en selecteer zebravissen met vergelijkbare engraftment. Verwijder ongeengrafeerde zebravissen. Voor dooier geïnjecteerd vis, verwijder vis waar grenzen van het juk niet kan worden gezien rond de gegrafeerde celmassa.
Voor pericardium geïnjecteerde vis, verwijder vis waar geïnjecteerde cel massa encroaches in de dooier zak. Om de geselecteerde vis over te brengen naar een 96-put plaat, eerst snijd de tip uit een 200 microliter pipet tip, net groot genoeg voor een vier dagen na bemesting zebra vissen om door te passen. Aspirate 150 microliters van E3 media met een zebra vis van de plaat met behulp van de P200 pipet en voeg het toe aan een lege put van een platte bodem 96-put plaat.
Voeg 150 microliters 2x verdunde geneesmiddelenoplossing toe aan elke put die zebravislarven bevat om een eindvolume van 300 microliters te bereiken met 1x medicijnoplossing per put. Broed de plaat uit op 34 graden Celsius. Controleer dagelijks op dode zebravissen.
Na twee dagen, indien gewenst, vernieuw het medicijn door 200 microliter vloeistof uit elke put te vervangen door 1X-medicijnoplossing of DMSO in E3-media. Verwijder in de Zen-blauwe software alle ongewenste tl-kanalen in de beeldsoftware en voeg het Dii-kanaal toe. Controleer het gewenste tl-kanaal.
Selecteer in hetzelfde venster hoe de beelden worden gemaakt, Z-stacks, automatisering, lussen en series, et cetera. Beeld de DMSO controle vissen voor de drug behandelde vissen. En stel de juiste belichtingstijd in de beeldsoftware.
Om de fluorescentie te kwantificeren, open imagej software. Ga naar het bestand, open en selecteer het gewenste CZI-bestand. De software brengt een venster met importopties.
Selecteer hyperstacks voor het bekijken van stapels, selecteer bestanden afzonderlijk, controleer de automatische schaal en controleert gesplitste kanalen. Selecteer voor de optie kleur de optie Kleur. Klik vervolgens op plug-ins, macro's, opnemen.
Klik op afbeelding, aanpassen, drempel. Selecteer afbeeldingstype als rood in het vervolgkeuzemenu aan de rechterkant van het drempelvenster. Pas de minimumdrempel aan totdat de software alleen gebieden met fluorescentie markeert en klik op toepassen.
De software zet de foto om naar zwart-wit met het geselecteerde gebied in het zwart. Klik op analyseren en meten. De software trekt een resultatenvenster omhoog dat het fluorescerende gebied voor dat beeld bevat.
Klik op maken in het macrorecordervenster. Hiermee wordt een nieuw venster geopend met de code voor de macro. Markeer alle gewenste afbeeldingen voor analyse en open volgens de weergave- of kleuroptie stapelen.
Selecteer uitvoeren op het venster met de macro. Het resultatenvenster bevat nu het gebied voor elke afbeelding. In dit protocol, bij 48 uur na injectie, xenografted vis werden gescreend op fluorescerend gelabelde tumorcellen en behandeld met chemotherapie of DMSO.
Over het algemeen vertoonde xenografeerde vis die met Vincristine werd behandeld de grootste en meest consistente daling van de xenograftedcelmassa in vergelijking met DMSO behandelde vis. Dexamethasone behandelde vis toonde ongeveer de helft van de vermindering van het tumorgebied in vergelijking met Vincristine. Maar nog steeds toonde een vermindering van het tumorgebied in vergelijking met DMSO.
Deze procedure kan worden gebruikt om een kankercellijn of patiëntenmonster te screenen op reactie op verschillende geneesmiddelen of specifieke gerichte therapieën die inzicht geven in de tumor van elke patiënt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
