Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish
Chapters
Summary April 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Zebrafish xenograft modeller möjliggör hög genomströmning läkemedelsscreening och fluorescerande avbildning av mänskliga cancerceller i en in vivo mikromiljö. Vi utvecklade ett arbetsflöde för storskalig, automatiserad läkemedelsscreening på patientbaserade leukemiprover i zebrafiskar med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop utrustad bildenhet.
Transcript
Vår zebrafisk xenograft drogscreening arbetsflöde möjliggör automatiserad bildbehandling och kvantifiering av mänskliga cancerceller och deras svar på läkemedelsbehandling. Det kan användas för att snabbt testa svaret av ett tålamods cancerceller till kända läkemedel eller för att identifiera nya anticancer föreningar. Använda zebrafish xenograph modeller och drog screening möjliggör Inviva replicant nummer som tidigare endast kan erhållas med in vitro-system.
Det är också mycket mer kostnadseffektivt än musmodeller vid screening genom stora bibliotek av föreningar. Detta arbetsflöde har flera steg från interjektion av cancerceller i zebrafisk till bildframställning av läkemedelsrespons som lärs bäst genom visuell demonstration. Till att börja med centrifug minst två gånger 10 till de sjätte cellerna i fem millimeter PBS vid 200 gånger g i fem minuter, och aspirera supernatanten.
Resuspend cell paletten i fem millimeter av dii färgning lösning. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius skyddas från ljus i 20 minuter. Sedan virvel försiktigt och inkubera cellerna på is i 15 minuter skyddas från ljus.
Sedan centrifugera cellerna på 200 gånger g i fem minuter och aspirera supernatanten. Tvätta cellerna genom att lägga till fem milliliter PBS, centrifugera vid 200 gånger g i fem minuter och aspirera supernatanten. Upprepa tvätten en extra gång.
Resuspend cellerna i en mikroliter av PBS per 250 tusen levande celler och överföra dem till en 1,5 millimeter mikro centrifug röret. Håll de återanvända cellerna på is i mörkret. Före färgning celler och injicera, gör agaros plattor för injicering genom att hälla 25 millileiers av tre procent uppstod i 1X TBE i en petriskål och låt den stelna.
Förvara plattorna i fyra grader Celsius i upp till två veckor. Även före färgning celler och injicera, dechlorinate två dagar efter befruktning zebra fisk med hjälp av tlyktor under en dissekera mikroskop. Dra från de motsatta ändarna av zebrafiskens skyddande chorion med tång tills chorion tårarna och zebrafisken blir outvecklad.
För att förhindra klumpar av celler under mikroinjection, pre chill icke fintrådiga borosilikat glasnålar vid fyra grader Celsius eller på is. Omedelbart efter färgning celler, använd en microloader pipett spets för att ladda fem mikroliter av färgade celler i kylda nålen. Ladda nålen i microinjector armen.
Jämna nålspetsen med hjälp av ett sterilt rakblad. Med hjälp av en steg mikrometer, mäta droppstorlek i mineralolja. Håll droppvolymen konsekvent vid två nanoliter, vilket är cirka 1,5 millimeter i diameter.
En minut efter anestesi, överför de sövda larverna till en förberedd plan yta injektionsplatta med tre procent agarose, och injicera larverna med en pump av färgade celler vid önskat injektionsställe. Alla injektioner ska slutföras inom en till tre timmar efter färgning av cellerna för att förhindra klumpning av nålen. Tvätta larverna av injektionsplattan i en 10 centimeter petriskål som innehåller E3-media utan metylenblått och inkubera vid 28 grader Celsius under en en timmes återhämtningsperiod.
Flytta skålen av de injicerade larverna i en 34 grader Celsius inkubator. Med en tom petriskål placerad mellan hyllan och petriskålen av larver för att fungera som en buffert. Vid 48 timmars post injektion, skärm zebra fisk larver för fluorescerande tumör cell engraftment och hälsa.
Ta bort alla döda eller missbildade zebrafiskar, och välj zebrafisk med liknande engraftment. Ta bort icke-förankrade zebrafiskar. För äggula injicerad fisk, ta bort fisk där okets gränser inte kan ses runt den engraftade cellmassan.
För perikardium injicerad fisk, ta bort fisk där injicerad cellmassa inkräktar i äggulan säcken. För att överföra den valda fisken till en 96-brunnsplatta, skär först spetsen av en 200 mikroliter pipett spets, bara tillräckligt stor för en fyra dagars efter befruktning zebra fisk att passa igenom. Aspirera 150 mikroliter av E3-media med en zebrafisk från plattan med hjälp av P200-pipetten och lägg den i en tom brunn av en platt botten 96-brunnsplatta.
Tillsätt 150 mikroliter av 2X utspädd läkemedelslösning till varje brunn som innehåller zebrafisklarver för att nå en slutlig volym på 300 mikroliter med 1X läkemedelslösning per brunn. Inkubera plattan vid 34 grader Celsius. Kolla efter döda zebrafiskar dagligen.
Efter två dagar, om så önskas, uppdatera läkemedlet genom att ersätta 200 mikroliter vätska från varje brunn med 1X läkemedelslösning eller DMSO i E3-media. I programvaran Zen blue tar du bort alla oönskade lysrörskanaler i bildhanteringsprogrammet och lägger till Dii-kanalen. Kontrollera önskad fluorescerande kanal.
I samma fönster väljer du hur bilderna ska tas, Z-stackar, automatisering, slingor och serier, et cetera. Bild DMSO kontroll fisk innan läkemedlet behandlade fisk. Och ställ in lämplig exponeringstid i bildhanteringsprogrammet.
För att kvantifiera fluorescensen, öppna imagej programvara. Gå till fil, öppna och välj önskad CZI-fil. Programvaran tar upp en import alternativ fönster.
För stapelvisning väljer du hyperstacks, kontrollerar öppna filer var för sig, kontrollerar automatisk skala och kontrollerar delade kanaler. För färgalternativet väljer du färgat. Klicka sedan på plugins, makron, spela in.
Klicka på bild, justera, tröskel. Välj bildtyp som röd i rullgardinsmenyn till höger i tröskelfönstret. Justera minimitröskeln tills programvaran bara framhäver områden med fluorescens och klicka sedan på Tillämpa.
Programvaran konverterar fotot till svartvitt med det valda området i svart. Klicka på analysera och mäta. Programvaran drar upp ett resultatfönster som innehåller fluorescerande området för den bilden.
Klicka på Skapa på makroinspelaren fönstret. Detta öppnar upp ett nytt fönster med koden för makrot. Markera alla önskade bilder för analys och öppna enligt stapling visning eller färg alternativ.
Välj kör på fönstret med makrot. Resultatfönstret innehåller nu området för varje bild. I detta protokoll, vid 48 timmars post injektion, xenografted fisk screenades för fluorescerande märkt tumörceller och behandlas med kemoterapi eller DMSO.
Totalt sett visade xenografted fisk behandlas med Vincristine den största och mest konsekventa minskningen i xenografted cell massa jämfört med DMSO behandlade fisk. Dexametason behandlade fisk visade ungefär hälften av minskningen i tumör område jämfört med Vincristine. Men ändå visade en minskning av tumör område jämfört med DMSO.
Detta förfarande kan användas för att screena någon cancer cellinje eller patientprov för svar på olika läkemedel eller specifika riktade terapier ger insikt i varje patients tumör.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
