Neuroscience
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電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製
Chapters
Summary May 7th, 2020
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提示されたプロトコルは、潜在的な抗てんかん物質の前臨床評価ツールとして重要な脳スライスを使用するという究極の目標を持つ切除されたヒト海馬組織の輸送および調製について説明する。
Transcript
私たちの技術を使用して、ヒト脳サンプル内の潜在的な抗てんかん物質をテストして、側頭葉てんかんの薬物開発を支援することができます。人間の脳組織は、基礎研究と臨床応用の間の翻訳キャップを破るという利点があります。手順の日または前日にできるだけ遅く、摂氏37度の水浴で10xコリンaCSF溶液の50ミリリットルを解凍し、解凍溶液と10倍溶液50ミリリットルを2〜約300ミリリットルの二重蒸留水に加えます。
混合物にグルコースと塩化カルシウムの最終的な濃度を追加し、溶解するまでかき混ぜます。その後、500ミリリットルの最終体積に二重蒸留水を加えます。オスモルの測定
そして、1xコリンaCSFの約100ミリリットルでボトルを充填します。手順の日に、氷の上に1xコリンaCSFを冷やし、少なくとも10〜15分間溶液をカルボゲネートするためにカルボーゲンガスに接続されたガラスガスディスペンサーを使用します。処置の少なくとも10〜15分前に、貯蔵aCSF、高カリウムプラス4アミノピリジンaCSF、および低マグネシウムプラスビクキュリンをカルボジネーションで摂氏35度に予熱する。
インターフェースチャンバーを準備するには、各スライス保持コンパートメントごとに4分2センチメートルのフィルターペーパーを2枚カットし、ピースを重ね合わせます。次に、フィルターペーパーの部分の周りに薄い綿の弦をコンパートメントの内側に置き、溶液の張力を壊し、均一な流れを確保します。各コンパートメントの大きなフィルターペーパーの上に3〜4個の1.5センチメートルのフィルターペーパーを置きます。
組織スライスを取得する前に、70%エタノールを使用して準備領域を拭き取り、カバーを領域の上に置きます。スーパー接着剤、2つの鋭いピンセット、へら、ブレード付きのメス、ビブラートムの近くの脳組織の粗い切断のためのブレードを配置します。ビブラートオムのバッファートレイと試料プレートを70%エタノールで拭きます。
バッファートレイが完全に乾燥したら、アルミホイルで覆い、トレイを氷浴に入れます。砕いた氷で氷浴を満たし、準備までマイナス20度で浴を維持します。その後、70%エタノールでビブラートとカミソリの刃を拭き、スライス手順中の垂直振動と組織の損傷を最小限に抑えるためにビブラートメを較正します。
組織サンプルを取得した直後に、輸送コリンaCSFから組織を取り除き、組織の焼けた部分を切り取る。均一な表面を切断して組織片を標本プレートに接着しやすくし、ビブラートオムを使用して脳組織を400マイクロメートル厚のスライスにスライスし、切断中に必要に応じてビブラートームの振幅と速度を調整します。ヒト海馬の一部は、他の部分よりも切断に対して耐性があります。
余分な注意と時間を取ることは、サンプルの品質を大幅に向上させることができます。メスを使用して脳のスライスをトリミングして記録室に収まり、ヘラと小さな鉗子を使用して、少なくとも1時間はインターフェイスチャンバーのフィルターペーパーの小片にスライスを慎重に配置します。てんかん活動記録のために、プラスチックリングに接着された半透過性の膜をチャンバに入れ、チャンバの流入管と流出管を蠕動ポンプに接続します。
あらかじめ温めたカルボゲン化されたaCSFでチューブとチャンバーを充填してください。記録電極を準備するために、154ミリモル塩化ナトリウム溶液で2メガオームガラスピペットを引っ張って充填します。ピペットを電極ホルダーに入れ、ピンセットとスパチュラを使用して、海馬スライスをインターフェイスチャンバーからカルボゲン化されたaCSFで満たされたペトリ皿に移します。
スライスを反転せずにフィルターペーパーを取り外し、スライスを記録チャンバーに入れます。スライスメッシュでスライスを所定の位置に保持し、目的の領域に電極を配置します。録音を開始します。
高カリウムプラス4-アミノピリジンによって誘発されるバースト活性は、洗浄後2〜5分で見える必要がありますが、低マグネシウムプラスビクキュリンによる発作様イベントの誘導は最大30分かかることがあります。高カリウムプラス4-アミノピリジンの適用は、数分以内にバーストイベントの形でてんかん活性を誘導する。10秒以上の持続時間を有する発作様事象は、低マグネシウムプラスビクキュリンの適用によって誘発され得る。
バーストイベントの数は、ラコサミドの適用時とジメチルエタノールアミンの適用の両方で減少しますが、振幅はほとんど影響を受けません。脳組織の質は、調製中の汚染および損傷を減らすことによっても改善することができる。また、我々の方法で作製されたヒト脳スライスは、パッチクランプを用いてニューロンの基本的な生理機能を調べたり、様々な技術を用いて遺伝子発現を調べたりする場合にも用いることができる。
世界中の研究室が人間の脳内の基本的なメカニズムを研究し始めており、これらの洞察は医薬品開発を支援するために使用することができ、提案された方法を使用してテストすることができます。
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