Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Det presenterade protokollet beskriver transport och beredning av resected mänskliga hippocampus vävnad med det slutliga målet att använda vitala hjärnan skivor som en preklinisk utvärdering verktyg för potentiella antiepileptiska ämnen.
Transcript
Med hjälp av vår teknik, vi kan testa potentiella anti-epileptiska ämnen inom mänskliga hjärnan prover till stöd i läkemedelsutveckling för temporala LOB epilepsi. Mänsklig hjärnvävnad har fördelen att bryta den translationella locket mellan grundforskning och kliniska tillämpningar. På dagen för förfarandet eller så sent som möjligt på dagen innan, tina 50 milliliter av en 10x kolin aCSF lösning i en 37 grader Celsius vattenbad och tillsätt tinade lösningen och 50 milliliter av 10x lösning två till cirka 300 milliliter dubbeldestillerat vatten.
Tillsätt slutliga koncentrationer av glukos och kalciumklorid till blandningen och rör om tills upplöst. Tillsätt sedan dubbeldestillerat vatten till en slutlig volym på 500 milliliter. Mät osmolariteten.
Och fyll en flaska med cirka 100 milliliter av 1x kolin aCSF. På dagen för förfarandet, kyla 1x kolin aCSF på is och använda en glasgas dispenser ansluten till carbogen gas till karbida lösningen i minst 10 till 15 minuter. Minst 10 till 15 minuter före förfarandet, före kriget lagringen aCSF, hög kalium plus 4-aminopyridine aCSF, och låg magnesium plus bicuculline till 35 grader Celsius med karbentering.
För att förbereda gränssnittet kammaren, skär två fyra-av-två-centimeter bitar av filterpapper för varje skiva-innehav fack och stapla bitarna ovanpå varandra. Placera sedan tunna bomullssträngar runt bitar av filterpapper inuti facken för att bryta spänningen i lösningen och för att säkerställa ett jämnt flöde. Och placera tre till fyra 1,5-av-en-centimeter bitar av filterpapper ovanpå den större bit av filterpapper i varje fack.
Innan du förvärvar vävnadsskivorna, använd 70%etanol för att torka av beredningsområdet och placera ett överdrag över området. Placera superlim, två vassa pincett, en spatel, en skalpell med blad, och ett blad för grov skärning av hjärnvävnaden nära vibratomen. Torka av buffertbrickan och provplåten på vibratomen med 70%etanol.
När buffertbrickan är helt torr, täck den med aluminiumfolie och placera brickan i isbadet. Fyll isbadet med krossad is och underhåll badet vid minus 20 grader Celsius tills förberedelserna. Torka sedan av vibratomen och rakbladet med 70%etanol och kalibrera vibratomen för att minimera eventuella vertikala vibrationer och vävnadsskador under skivningsproceduren.
Omedelbart efter att förvärva vävnadsprovet, ta bort vävnaden från transporten kolin aCSF och skära bort eventuella brända delar av vävnad. Skär en jämn yta för att underlätta limning av vävnadsbiten på preparatplattan och använd vibratomen för att skära hjärnvävnaden i 400 mikrometertjocka skivor, justera amplituden och hastigheten på vibratomen vid behov under skärningen. Vissa delar av den mänskliga hippocampus kan vara mer resistenta mot skärning än andra.
Att vara extra försiktig och tid kan kraftigt förbättra provkvaliteten. Använd en skalpell för att trimma hjärnan skivor för att passa in i inspelningen kammaren och använda en spatel och små tynningar för att försiktigt placera skivor på de små bitar av filterpapper i gränssnittet kammaren i minst en timme. För epileptiform aktivitetsregistrering, placera ett semipermeabelt membran limmat på en plastring i kammaren och koppla kammarens inflödes- och utflödesrör till en peristaltisk pump.
Fyll rören och kammaren med förvärmd karbiogenerad aCSF. För att förbereda inspelningen elektroder, fill drog en till två megaohm glas pipetter med 154 millimolar natriumklorid lösning. Placera pipetterna i en elektrodhållare och använd pincett och en spatel för att överföra en hippocampusskiva från gränssnittskammaren till en petriskål fylld med karbiogenerad aCSF.
Ta bort filterpapperet utan att vända på skivan och placera segmentet i inspelningskammaren. Håll skivan på plats med skiva mesh och placera elektroderna i den region av intresse. Påbörja inspelningen.
Den burst aktivitet framkallas av den höga kalium plus 4-aminopyridin bör vara synlig två till fem minuter efter tvätt i, medan induktion av beslag-liknande händelser av låg magnesium plus bicuculline kan ta upp till 30 minuter. Tillämpningen av hög kalium plus 4-aminopyridin inducerar epileptiform aktivitet i form av burst händelser inom några minuter. Beslag-liknande händelser med en varaktighet på över 10 sekunder kan induceras med tillämpning av låg magnesium plus bicuculline.
Antalet burst-händelser minskar både under appliceringen av lasamid och appliceringen av dimetyletanolamin, även om amplituderna för det mesta inte påverkas. Kvaliteten på hjärnvävnaden kan också förbättras genom att minska kontamineringen och skadorna under preparatet. Mänskliga hjärnskivor som beretts med våra metoder kan också användas för att undersöka grundläggande fysiologiska funktioner hos nervceller med hjälp av patch clamp eller undersöka genuttryck med hjälp av olika tekniker.
Labs över hela världen har börjat studera grundläggande mekanismer inom den mänskliga hjärnan, och dessa insikter kan användas för att stöd i läkemedelsutveckling och kan testas med hjälp av våra föreslagna metoder.
Tags
Neurovetenskap elektrofysiologi epilepsi läkemedelsutveckling människa hippocampus ex vivoRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
